In Vivo Tri-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette In Vivo Tri-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette In Vivo
Summary
Nous présentons une procédure d’éjection locale optimisée utilisant une micropipette en verre et une méthode rapide d’imagerie d’hyperpile de deux photons, qui permet la mesure précise des changements de diamètre capillaire et l’étude de sa régulation en trois dimensions.
Abstract
Le maintien de la fonction cérébrale normale nécessite un approvisionnement suffisant et efficace en oxygène et en nutrition par un réseau complexe de vaisseaux. Cependant, la régulation du flux sanguin cérébral (CBF) est incomplètement comprise, particulièrement au niveau capillaire. La microscopie à deux photons est un outil puissant largement utilisé pour étudier la CBF et sa régulation. À l’heure actuelle, ce domaine est limité par l’absence d’études in vivo de microscopie à deux photons examinant (1) les réponses CBF en trois dimensions, (2) les réponses vasculaires menées et (3) les interventions localisées au sein du réseau vasculaire. Ici, nous décrivons une méthode in vivo 3D utilisant la microscopie de deux photons pour étudier les réponses vasculaires menées obtenues par l’éjection locale de l’ATP avec une micro-pipette en verre. Notre méthode utilise l’imagerie rapide et répétitive de deux photons d’hyperpile fournissant des mesures précises de diamètre par projection d’intensité maximale des images obtenues. En outre, nous montrons que cette méthode peut également être utilisée pour étudier les réponses 3D de calcium astrocytique. Nous discutons également des avantages et des limites de l’insertion de micropipette en verre et de l’imagerie d’hyperpile à deux photons.
Introduction
Le cerveau a un taux de consommation d’énergie élevé. Environ 20% de l’oxygène et 25% du glucose consommé par le corps humain sont dédiés à la fonction cérébrale, tandis que le cerveau occupe seulement 2% de la masse corporelle totale. Le maintien de la fonction cérébrale normale nécessite un approvisionnement suffisant et efficace en oxygène et en nutrition par le flux sanguin dans un réseau complexe de vaisseaux. L’activité cérébrale locale et le flux sanguin cérébral (CBF) sont solidement couplés, selon les propriétés fonctionnelles des neurones, des astrocytes, des péricytes, des cellules musculaires lisses (SMC) et des cellules endothéliales (EC)1. Récemment, les premiers ordres de capillaires ramifiant des artérioles pénétrantes ont émergé comme un «hotspot»2, montrant une régulation active de la circulation sanguine capillaire. Une réponse vasculaire menée lentement (CVR) a été découverte à ce « point chaud » dans le cortex somatosensoriel de souris pendant la stimulation de moustaches et l’éjection locale (puffing) de l’ATP avec une micro-pipetteenverre 3.
Bien que l’imagerie in vivo par microscopie fluorescente à balayage laser à deux photons ait été largement utilisée pour étudier les réponses neurovasculaires dans le cortex cérébral, la plupart des études ont mesuré le diamètre des vaisseaux sanguins et étudié leur régulation dans un plan x-y en deux dimensions (2D). Les défis sont les : Tout d’abord, les vaisseaux sanguins cérébraux et leurs astrocytes, péricytes et SMC construisent des branches en trois dimensions (3D). Il est donc crucial d’étudier leurs interactions en 3D. Deuxièmement, même une petite quantité de dérive dans la mise au point affectera la mesure précise des diamètres des navires et des signaux fluorescents cellulaires. Enfin, les CVR sont rapides et de grande portée en trois dimensions. La numérisation du volume 3D est optimale pour détecter les CVR et dévoiler leurs mécanismes. Nous avons mis en œuvre un objectif de moteur piezo dans un microscope à deux photons pour étudier le cortex somatosensoriel de souris in vivo, permettant des mesures précises de diamètre par des projections d’intensité maximale des images obtenues.
Les micro-pipettes en verre ont souvent été utilisées pour des études in vivo sur le cerveau, par exemple pour charger en vrac des colorants organiques4, enregistrer les EEG5 et pour le clampage des timbres6. Néanmoins, des limites subsistent. Généralement, la pointe de la micro-pipette en verre est imprécise, ou la micro-pipette n’est pas utilisée pour les interventions locales. Ici, nous avons optimisé la procédure d’insertion de micro-pipettes et d’éjection locale.
En outre, la combinaison de la microscopie 3D à deux photons et d’indicateurs fluorescents génétiquement codés offre une occasion sans précédent d’étudier le couplage neurovasculaire dans une portée 3D. Dans cette étude, nous avons profité de ceci et avons injecté des vecteurs viraux portant des indicateurs de calcium génétiquement-encodés spécifiques d’astrocyte dans le cortex somatosensory de souris. Les astrocytes ainsi que les diamètres des vaisseaux ont été photographiés simultanément en combinant différents marqueurs fluorescents.
Dans l’ensemble, nous présentons une méthode optimisée d’éjection locale (puffing) par micro-pipette en verre et l’imagerie rapide de l’hyperpile à deux photons, qui permet de mesurer avec précision les changements de diamètre capillaire. En outre, notre méthode fournit un nouvel outil pour étudier simultanément les profils 3D des réponses Ca2 dans les astrocytes et les réponses de diamètre vasculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un défi pour les études vasculaires est la mesure précise du diamètre des vaisseaux. La méthode que nous décrivons ici a employé un objectif motorisé de piezo pour faire l’imagerie rapide et répétitive d’hyperpile par microscopie de deux photons. Tout d’abord, cette méthode permet des examens répétés de l’artériole pénétrante, 1er ordre et 2 capillaires d’ordre sans perte de concentration et a conduit à la découverte de réponses vasculaires lentement menées dans les capillaires in vivo.<su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la Fondation Lundbeck, la Fondation NOVO-Nordisk, le Conseil danois pour la recherche indépendante . Medical Sciences, et la subvention de la Fondation NORDEA au Center for Healthy Aging.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
Referenzen
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