In vivo drie-dimensionale twee-Fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale ATP-ejectie met behulp van een glazen micro pipet
Summary
We presenteren een geoptimaliseerde lokale ejectieprocedure met behulp van een glazen micro-pipet en een snelle twee-fotonen hyperstack-beeldvormings methode, die nauwkeurige meting van veranderingen in de capillaire diameter mogelijk maakt en het onderzoek van de verordening in drie dimensies.
Abstract
Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door een complex netwerk van schepen. Echter, de regulering van cerebrale doorbloeding (CBF) is niet volledig begrepen, vooral op het capillaire niveau. Two-photon microscopie is een krachtig hulpmiddel op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van CBF en de verordening. Momenteel wordt dit veld beperkt door het ontbreken van in vivo twee-fotonen microscopie studies die onderzoeken (1) CBF-responsen in drie dimensies, (2) voerden vasculaire reacties uit en (3) gelokaliseerde interventies binnen het vasculaire netwerk. Hier beschrijven we een 3D in vivo-methode met behulp van twee-fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire reacties te bestuderen die worden opgewekt door lokale uitwerpen van ATP met een glazen micro pipet. Onze methode maakt gebruik van snelle en repetitieve hyperstack Two-photon Imaging voor nauwkeurige diameter metingen door de maximale intensiteit projectie van de verkregen beelden. Bovendien tonen we aan dat deze methode ook kan worden gebruikt om 3D astrocytische calcium responsen te bestuderen. We bespreken ook de voordelen en beperkingen van het inbrengen van glazen micropipetten en twee Fobe hyperstack-beeldvorming.
Introduction
De hersenen hebben een hoog energieverbruikpercentage. Ongeveer 20% van de zuurstof en 25% van de glucose verbruikt door het menselijk lichaam zijn gewijd aan de hersenfunctie, terwijl de hersenen slechts 2% van de totale lichaamsmassa inneemt. Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door de bloedtoevoer in een complex netwerk van schepen. Lokale hersenactiviteit en cerebrale doorbloeding (CBF) zijn robuust gekoppeld, afhankelijk van de functionele eigenschappen van neuronen, astrocyten, pericytes, gladde spiercellen (Smc’s) en endotheel cellen (ECs)1. Onlangs zijn de eerste paar orders van capillairen vertakkingen van penetrerende arteriolen ontstaan als een ‘ hotspot ‘2, met actieve regulering van capillaire bloedstroom. Een traag uitgevoerde vasculaire respons (CVR) werd ontdekt in deze ‘ hotspot ‘ in de muis Somatosensorische cortex tijdens zowel whisker stimulatie en lokale ejectie (puffing) van ATP met een glazen micro-pipet3.
Hoewel in vivo imaging by Two-photon laser scanning fluorescerende microscopie is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neurovasculaire reacties in de hersenschors, de meeste van de studies gemeten bloedvat diameters en onderzocht hun verordening in een tweedimensionaal (2D) x-y-vlak. De uitdagingen zijn: ten eerste, cerebrale bloedvaten en hun omarmen astrocyten, pericytes en SMCs construeren takken in drie dimensies (3D). Het is daarom van cruciaal belang om hun interacties in 3D te bestuderen. Ten tweede zal zelfs een kleine hoeveelheid drift in de focus de precieze meting van zowel de diameter van het vaartuig als de cellulaire fluorescerende signalen beïnvloeden. Tot slot zijn de CVRs snel en verreikend in drie dimensies. 3D-volume scanning is optimaal voor het opsporen van Cvr’s en het ontdekken van hun mechanismen. We implementeerden een piëzo-motorische doelstelling in een twee-Fobe Microscoop om de muis Somatosensorische cortex in vivo te bestuderen, waardoor precieze diameter metingen mogelijk werden door maximale intensiteits projecties van de verkregen beelden.
Glas micro-pipetten zijn vaak gebruikt voor in vivo hersenstudies, bijvoorbeeld om organische kleurstoffen in bulk te laden4, EEGs5 op te nemen en voor patch klemmen6. Niettemin, beperkingen blijven. Gewoonlijk wordt de punt van de glazen micro-pipet onrustig geplaatst of wordt de micro pipet niet gebruikt voor lokale ingrepen. Hier hebben we de procedure voor het inbrengen van micropipetten en lokale uitwerpen geoptimaliseerd.
Bovendien biedt de combinatie van 3D twee-photon microscopie en genetisch gecodeerde fluorescerende indicatoren een ongekende kans om neurovasculaire koppeling in een 3D-scope te onderzoeken. In deze studie, we profiteerde van deze en geïnjecteerd virale vectoren die astrociet specifieke genetisch gecodeerde calcium indicatoren in de muis Somatosensorische cortex. Astrocyten en de diameter van het vat werden gelijktijdig afgebeeld door verschillende fluorescerende markers te combineren.
Over het algemeen presenteren we een geoptimaliseerde methode van lokale ejectie (puffing) door glazen micro-pipet en snelle Two-photon hyperstack Imaging, die nauwkeurige meting van capillaire diameter wijzigingen mogelijk maakt. Daarnaast biedt onze methode een nieuwe tool om tegelijkertijd 3D-profielen van CA2 + -reacties in astrocyten en vasculaire diameter reacties te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een uitdaging voor vasculaire studies is de precieze meting van de diameter van het vat. De methode die we hier beschrijven gebruikten een gemotoriseerde piëzo-doelstelling om snelle en repetitieve hyperstack-beeldvorming te maken met twee fotonmicroscopie. Ten eerste, deze methode maakt herhaalde onderzoeken van de penetrerende Arteriole, 1St orde en 2ND orde capillairen zonder verlies van focus en leidde tot de ontdekking van langzaam uitgevoerde vasculaire reacties in capillairen in vivo. Ten tw…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door de Stichting Lundbeck, de Stichting NOVO-Nordisk, de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek | Medische wetenschappen, en de NORDEA Foundation verlenen aan het centrum voor gezonde veroudering.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
Referenzen
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
