اعداد وتطبيق البكتيريا الجرثومية الجديدة للكشف المفترض لبقايا الطلقات النارية
Summary
يتم تقديم بروتوكول باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية لتوليف مجموعه من البكتيريا البيولوجية البكتيرية لتحليل بقايا الطلقات النارية ، واختبار أداء الاجهزه لاستخدامها المقصود باستخدام الطيفية الفلورية.
Abstract
Microbocop هو هو استشعار التي تم تصميمها لتطبيق فريد من نوعه في الكيمياء الشرعية. MicRoboCop هو نظام يتكون من ثلاثه أجهزه التي ، عند استخدامها معا ، يمكن ان تشير إلى وجود بقايا الطلقات النارية (GSR) عن طريق إنتاج اشاره مضان في وجود ثلاثه التحاليل الرئيسية (الإثمد ، والرصاص ، والمكونات العضوية من GSR). ويصف البروتوكول توليف الاجهزه البيولوجية باستخدام القولونية (كولاي) ، وأساليب الكيمياء التحليلية المستخدمة لتقييم الانتقائية وحساسية المستشعرات. ويتجلى أداء النظام باستخدام GSR الذي تم جمعه من داخل غلاف خرطوشه مستهلكه. وبمجرد الاعداد ، يمكن تخزين العناصر البيولوجية حتى الحاجة ويمكن استخدامها كاختبار لهذه التحاليل الرئيسية. وتوفر الاستجابة الايجابيه من جميع التحاليل الثلاثة اختبارا إيجابيا افتراضيا لهذه الاداه ، في حين ان كل جهاز علي حده لديه تطبيقات للكشف عن التحاليل في عينات أخرى (مثل كاشف للتلوث بالرصاص في مياه الشرب). والقيد الرئيسي لهذا النظام هو الوقت اللازم للاشاره الايجابيه ؛ قد يتضمن العمل المستقبلي دراسة الكائنات الحية المختلفة لتحسين وقت الاستجابة.
Introduction
الجهاز الحيوي هو اي أداه تحليليه تستخدم المكونات البيولوجية (مثل البروتينات أو الأحماض النووية أو الكائنات الحية الكاملة) التي تنتج الاستجابة التي يمكن استخدامها للكشف عن ماده كيميائية أو تحليليه. وكمثال علي ذلك ، استخدمت صناعه تعدين الفحم البيولوجي لفتره طويلة من القرن العشرين للكشف عن وجود غازات ألغام السامة: الكناري في منجم الفحم1. وقد لاحظ عمال المناجم استجابه الكائن البيولوجي (الوفاة أو الكرب) لماده كيميائية (أول أكسيد الكربون) من أجل حماية العمال. في مثال أكثر حداثة وتطورا ، يمكن تغيير البكتيريا باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية للرد علي وجود تحلل كيميائي معين من خلال إظهار استجابه محدده ، مثل التعبير عن بروتين فلوري.
البيولوجيا التركيبية عبارة واسعه النطاق تشير إلى بناء الاجهزه والنظم البيولوجية التي لا توجد بشكل طبيعي ، أو أعاده تصميم النظم البيولوجية القائمة لغرض محدد2. وتتميز البيولوجيا التركيبية بالهندسة الوراثية بمنهجيه قياسيه وبوجود أجزاء موحده (عناصر وراثيه لعلم الاحياء التركيبية القياسية) يمكن استخدامها لتوليف الاجهزه والنظم. يتم إدخال جزء في جينوم الجهاز ، كائن حي مثل البكتيريا ، للتعبير عن سمه معينه من شانها ان تكون بمثابه مؤشر علي وظيفة. علي سبيل المثال ، في العديد من الاجهزه الاصطناعية ، يتم إدخال التعبير عن البروتين الفلوري في كائن واحد الخلية كبروتين مراسل. يمكن دمج أجهزه متعددة في نظام. الجينوم من الكائنات المجهرية مثل البكتيريا من السهل التلاعب بها بهذه الطريقة. وقد ابلغ عن العديد من الامثله علي المواد البيولوجية المحددة لمجموعه واسعه من التحاليل الكيميائية في الأدبيات علي مدي العقد الماضي3,4.
وفي هذا العمل ، يقدم نظام MicRoboCop كمثال علي الاستشعار البيولوجي أو المصمم باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية مع تطبيقات جديده في الكيمياء الشرعية والبيئية. MicRoboCop هو نظام من ثلاثه أجهزه منفصلة ، عندما مجتمعه ، وسوف تسمح القولونية للتعبير عن البروتين الفلوري الأحمر (العطاء) في وجود بقايا طلقات ناريه (GSR) التي تم جمعها من ايدي الشخص أو سطح. كل من الاجهزه الثلاثة يستجيب للتحليل الكيميائي المحدد الذي يعرف بأنه مكون من GSR5. التحاليل الثلاثة التي يستجيب لها النظام هي I. 2 ، 4 ، 6-ترينيتروولويني (TNT) والمركبات ذات الصلة ، ثانيا. الرصاص (في شكل أيونات الرصاص) ، وثالثا. الإثمد (أيضا في شكل أيونات).
GSR يتكون من العديد من المواد الكيميائية المختلفة ، ولكن الثلاثة عاده ما تستخدم لتحديد بقايا كما GSR هي الباريوم ، الرصاص ، والإثمد5. اختبار الادله القياسية لتحديد GSR هو استخدام المجهر الكترون المسح الضوئي (SEM) مع التشتت الطاقة الاشعه السينية فلوري (EDX)5. تسمح SEM-EDX للمحللين بتحديد الشكل الفريد والمكونات العنصرية لل GSR. في الحاضر ، هناك عدد قليل من الاختبارات الافتراضية الثنائية المستخدمة علي نطاق واسع المتاحة. ويستخدم أحد الاختبارات الافتراضية التي نشرت مؤخرا التحليل الطيفي للتنقل الأيوني (IMS) ، وهو معدات متخصصة قد لا تكون متاحه في العديد من المختبرات6. وهناك أيضا عدد قليل من ألوان “بقعه” الاختبارات التي يمكن استخدامها ، علي الرغم من انها تستخدم عاده لتحديد المسافة أو لتحديد GSR علي ثقوب الرصاصة والجروح5. بالاضافه إلى ذلك ، كان هناك بعض الاهتمام المحدود في الأدب إلى الاختبارات الكهروكيميائية ل GSR التي توظف تحليل فولتاممتري ، والتي لديها ميزه احتمال كونها الميدانية المحمولة ، أو انوديك تجريد voltammetric ، وهو غاية طريقه حساسة للعناصر المعدنية7. وهناك القليل جدا من الاشاره في أدبيات الاستشعار البيولوجي المصممة خصيصا لغرض الكشف عن GSR ، علي الرغم من نشر بعض المواد البيولوجية لتطبيقات الطب الشرعي الأخرى8.
وترد في الشكل 1العناصر البيولوجية لكل جهاز في نظام microbocop ، وبناء البلازميد. السهم المنحني في الشكل 1b يمثل المنطقة المروج التي يتم تنشيطها في وجود التحليلية ، والبيضاوي هو موقع ربط ريبوسومال الذي يسمح ترجمه البروتين المراسل ، المربع الرمادي المسمي عروض العروض هو الجين الذي يعبر عن الأحمر البروتين الفلوري ، والمثمن الأحمر هو موقع إنهاء النسخ. سيتم استخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا كنظام للكشف عن GSR. سيتم احتضان كل جهاز مع مروج محدد (SbRFP ، PbRFP ، و TNT-عروض العروض) مع العينة التي يتم اختبارها سيتم قياس الفلورية لعروض العروض. ولن يتم التعبير عن تقديم العروض الا إذا كان التحلل الكيميائي المناسب موجودا وينشط منطقه المروج. وقد تم تصميم ثلاثه أجهزه تستجيب لبعض المواد الكيميائية الموجودة في GSR ويتم عرضها في هذا العمل.
المروجين المستخدمة في الاجهزه microbocop الثلاثة هي الزرنيخ والداعم إثمد الحساسة, sbrfp9,10, المروج الحساسة الرصاص, pbrfp11,12 والمروج الحساسة TNT, TNT- عروض العروض 13. لان البحث في الأدبيات كشفت عن اي مروج مصممه للرد علي الباريوم ، تم اختيار المروج TNT بدلا من ذلك لان هذا المروج حساس لعدد من المركبات ذات الصلة هيكليا (علي وجه الخصوص ، 2 ، 4-dinitrotoluene و dinitrobenzene) التي من المعروف انها جزء من المركبات العضوية تركت وراءها في GSR. وقد استخدم هذا المروج بنجاح للكشف علي وجه التحديد كميات دقيقه من TNT و 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) في ألغام الارضيه المدفونة13. باستخدام الاجهزه الثلاثة معا كنظام ، سينتج اختبار إيجابي ل GSR مضان في جميع الاجهزه الثلاثة. اشاره مضان في جهاز واحد أو اثنين فقط سوف تشير إلى مصدر بيئي آخر للتحليل (ق) أو في حاله المروج TNT ، التنشيط من قبل مركب ليس مركب عضوي تركت وراءها في GSR. وباستخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا ، يتم التقليل إلى ادني حد من امكانيه حدوث نتائج ايجابيه زائفه بسبب المصادر البيئية. ولا تزال الذخيرة الخالية من الرصاص ، التي تكتسب شعبيه ، لا تمثل سوي 5 في المائة من مبيعات الذخيرة في الولايات المتحدة ؛ التالي ، قد تكون النتائج السلبية كاذبه بسبب عدم وجود الرصاص احتمال ولكن لا يزال هناك فائده في جهاز استشعار يستخدم الرصاص كعلامة ل GSR14. الاضافه إلى هذا التطبيق المحدد للطب الشرعي ، يمكن استخدام كل جهاز بشكل منفصل لأغراض الكشف عن الملوثات البيئية.
وتشمل البروتوكولات المقدمة تقنيات البيولوجيا التركيبية المستخدمة لإنشاء الاجهزه (بكتيريا المستشعر) والتقنيات التحليلية للتحقق من وظيفة الاجهزه وتحليل الإشارات الفلورية التي تم الحصول عليها. ويشمل البروتوكول أيضا جمع أدله الطب الشرعي في شكل مسح اليد لجمع GSR من يد المشتبه به أو مسحه لجمع GSR من السطح. يتم عرض النتائج من جهاز استشعار الرصاص علي سبيل المثال النتائج ، إلى جانب إظهار اختبار إيجابي ل GSR باستخدام غلاف خرطوشه المستهلكة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
ويمكن تعديل التجربة الموصوفة في الجدول 4 بأي شكل من الاشكال بما يتناسب مع أجهزه الاستشعار التي تم تصميمها. الجانب الأكثر اهميه في المستشعر الكيميائي هو تقييم حساسيته وخصوصيته. ومن المفيد ضمان تحليل مجموعه واسعه من ترك?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويرغب المؤلفون في الاعتراف بالطلاب في جامعه لونغوود في 324 BIOL (علم الوراثة) والطلاب في تشيم 403 (المختبر الكيميائي المتقدم لحل المشكلات) الذين شاركوا في الاعداد الاولي واختبار الإثمد والرصاص الحيوي. وقد تم تصور فكره MicRoboCop في ورشه عمل GCAT SynBIO (الصيف 2014) ، والتي يتم تمويلها من قبل NSF ومعهد هوارد هيوز الطبي والتي تستضيفها جامعه ميريلاند مقاطعه بالتيمور. ويعترف المؤلفون أيضا بالتمويل الوارد من كليه كوك-كول للفنون والعلوم بجامعه لونغوود ومنحه خريجي GCAT SynBio.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
Referenzen
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , (2016).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications – An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
