הכנה ויישום של ביוסנסור בקטריאלי חדש לאיתור שוערת של שאריות ירי
Summary
פרוטוקול מוצג באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי כדי לסנתז סט של חיישנים ביולוגיים לניתוח שאריות ירי, כדי לבדוק את תפקוד המכשירים לשימוש המיועד שלהם באמצעות ספקטרוסקופיית הזריחה.
Abstract
Microbocop הוא ביוסנסור כי תוכנן עבור יישום ייחודי בכימיה משפטית. MicRoboCop היא מערכת מורכבת משלושה מכשירים כי, כאשר משתמשים יחד, יכול להצביע על נוכחות של שאריות ירי (GSR) על ידי הפקת אות פלואורסצנטית בנוכחות של שלושה אנליטים מפתח (אנטימון, עופרת, ורכיבים אורגניים של GSR). הפרוטוקול מתאר את הסינתזה של הביוחיישנים באמצעות es, coli קולי (E. coli), ושיטות הכימיה האנליטיות המשמשות להערכת הסלקטיביות והרגישות של החיישנים. תפקוד המערכת מוצג באמצעות GSR שנאסף מתוך מעטפת מחסנית בילה. ברגע שהוכן, הביוחיישנים ניתן לאחסן עד הצורך, והוא יכול לשמש כמבחן עבור אלה מקשים מנתחי. תגובה חיובית של כל שלושת האנליטים מספק בדיקה חיובית שוערת עבור GSR, בעוד כל מכשיר בודד יש יישומים לגילוי האנליטים בדגימות אחרות (למשל, גלאי להוביל זיהום מים שתייה). המגבלה העיקרית של המערכת היא הזמן הנדרש עבור אות חיובי; עבודה עתידית עשויה להיות כרוכה בלימוד אורגניזמים שונים כדי למטב את זמן התגובה.
Introduction
ביוסנסור הוא כל מכשיר אנליטי המשתמשת ברכיבים ביולוגיים (כגון חלבונים, חומצות גרעין, או אורגניזמים שלמים) המייצרים תגובה כי ניתן להשתמש לאיתור חומר כימי או מכשיר. כדוגמה, תעשיית כריית הפחם בשימוש ביוסנסור עבור הרבה של המאהה -20 כדי לזהות את הנוכחות של גזים רעילים מוקש: הקנרית במכרה פחם1. תגובת האורגניזם הביולוגי (מוות או מצוקה) לאנליטה כימית (פחמן חד-חמצני) נצפתה על ידי הכורים כדי להגן על העובדים. בדוגמה מודרנית ומתוחכמת יותר, ניתן לשנות חיידקים באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטית כדי להגיב לנוכחות של משתמש כימי מסוים על ידי המציגות תגובה ספציפית, כגון ביטוי של חלבון פלורסנט.
ביולוגיה סינתטית היא מונח רחב המתייחס לבניית מכשירים ביולוגיים ומערכות שאינן קיימות באופן טבעי, או עיצוב מחדש של מערכות ביולוגיות קיימות למטרה מסוימת2. ביולוגיה סינתטית נבדל מהנדסה גנטית על-ידי מתודולוגיה סטנדרטית וקיום חלקים סטנדרטיים (אלמנטים גנטיים סטנדרטיים בביולוגיה סינתטי) שניתן להשתמש בהם כדי לסנתז מכשירים ומערכות. חלק מוצג לתוך הגנום של המכשיר, אורגניזם כגון חיידק, כדי לבטא תכונה מסוימת שתשמש כאינדיקציה לפונקציה. לדוגמה, במכשירים סינתטיים רבים, הביטוי של חלבון פלורסנט מוצג לתוך אורגניזם תא יחיד כחלבון עיתונאי. ניתן לשלב התקנים מרובים במערכת. הגנום של מיקרואורגניזמים כגון חיידקים קל לתמרן באופן זה. דוגמאות רבות של ביוחיישנים ספציפיים למגוון רחב של מנתחי כימיים דווחו בספרות בעשור האחרון3,4.
בעבודה זו, מערכת microbocop מוצג כדוגמה ביוסנסור שתוכננה באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי עם יישומים חדשניים בכימיה משפטית וסביבתית. MicRoboCop היא מערכת של שלושה מכשירים נפרדים, כי, כאשר בשילוב, יאפשר es, coli לבטא חלבון פלורסנט אדום (rfp) בנוכחות של שאריות ירי (gsr) כי נאסף מידי אדם או משטח. כל אחד משלושת המכשירים מגיב למכשיר כימי מסוים שידוע כמרכיב של GSR5. שלושת האנליטים שבהם המערכת מגיבה הם אני. 2, 4, 6-trinitrotolene (TNT) ותרכובות קשורות, II. עופרת (בצורת יונים מובילים) ו-III. אנטימון (גם בצורת יונים).
GSR מורכב מחומרים כימיים רבים ושונים, אבל השלושה משמשים בדרך כלל כדי לזהות שאריות כמו GSR הם בריום, עופרת, ו אנטימון5. בדיקת הראיות הסטנדרטית לזיהוי של GSR היא להשתמש סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) עם אנרגיה מפזרים X-ray פלואורסצנטית (EDX)5. SEM-EDX מאפשר לאנליסטים לזהות את המבנה הייחודי ואת הרכיבים היסודיים של GSR. כיום, ישנם מספר בדיקות שימוש נרחב שוערת בינארי זמין. בדיקה שוערת שפורסמה לאחרונה משתמשת בספקטרוסקופיית מוביליות (IMS), שהיא ציוד מיוחד שעשוי שלא להיות זמין במעבדות רבות6. יש גם כמה צבעים “ספוט” בדיקות שניתן להשתמש בהם, למרות שהם משמשים בדרך כלל לקביעת מרחק או לזיהוי GSR על חורי קליע ופצעים5. בנוסף, יש כבר כמה תשומת לב מוגבלת בספרות כדי בדיקות אלקטרוכימי של GSR כי להעסיק ניתוח וולטמטרי, אשר יש את היתרון של הפוטנציאל להיות נייד בתחום, או בנוכחות אנוטמטריה הלונדית, שהיא מאוד שיטה רגישה לאלמנטים מתכתיים7. יש מעט מאוד להזכיר בספרות של אנלייזרים תוכנן במיוחד לצורך זיהוי gsr, למרות כמה ביולוגי יישומים משפטיים אחרים פורסמו8.
האלמנטים הביולוגיים של כל מכשיר במערכת המיקרובווטר, והבנייה הפלסמיד, מומחשים באיור 1. החץ המעוקל באיור 1b מייצג את אזור המקדם המופעל בנוכחות האנליטה, האליפסה היא אתר הכריכה הריבוזומלי המאפשר תרגום של חלבון הכתב, התיבה האפורה הנקראת rfp הוא הגן המבטא אדום חלבון פלורסנט, והמתומן האדום הוא האתר לסיום התמלול. כל שלושת המכשירים ישמשו יחד כמערכת כדי לזהות GSR. כל התקן עם מיזם מסוים (SbRFP, PbRFP, ו-TNT-RFP) יהיה מודבטים עם המדגם כי הוא נבדק והזריחה של RFP יהיה נמדד. RFP יהיה רק להתבטא אם האנליטה הכימי המתאים קיים ומפעיל את אזור היזם. שלושה מכשירים המגיבים לחלק מהחומרים הכימיים המצויים בתוך GSR תוכננו ומוצגים בעבודה זו.
היזמים המשמשים את שלושת המכשירים microbocop הם מקדם ארסן ו אנטימון רגיש, sbrfp9,10, מקדם רגיש להוביל, pbrfp11,12 ו מיזם רגיש TNT, TNT-RFP 13. בגלל חיפוש בספרות חשף מקדם שנועד להגיב בריום, מיזם TNT נבחר במקום מיזם זה הוא רגיש למספר תרכובות קשורות מבנית (בפרט, 2, 4-dinitrotoluene ו dinitrobenzene נזן) כי הם ידועים להיות חלק התרכובות אורגני שנותרו מאחור GSR. יזם זה בהצלחה שימש לזהות באופן ספציפי כמויות דקות של TNT ו 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) במכרות אדמה קבורים13. באמצעות שלושת המכשירים יחד כמערכת, בדיקה חיובית עבור GSR יפיק פלואורסצנטית בכל שלושת המכשירים. אות פלואורסצנטית רק אחד או שניים התקנים יציין מקור אחר של הסביבה של האנליטה (s) או במקרה של מקדם TNT, הפעלה על ידי תרכובת שאינה תרכובת אורגנית שנותרה מאחור ב-GSR. על ידי שימוש בכל שלושת המכשירים יחד, האפשרות של תוצאות חיוביות שווא בשל מקורות סביבתיים הוא ממוזער. תחמושת ללא עופרת, הצוברת פופולריות, עדיין מייצגת רק כ -5% ממכירת התחמושת בארצות הברית; מכאן, תוצאות שליליות שווא בשל היעדר העופרת עשויה להיות אפשרות אבל יש עדיין שירות בחיישן המשתמשת להוביל כסמן עבור GSR14. בנוסף ליישום המשפטי הספציפי הזה, ניתן להשתמש בכל אחד מההתקנים בנפרד לצורך זיהוי מזהמים סביבתיים.
הפרוטוקולים המוצגים כוללים את טכניקות ביולוגיה סינתטי המשמשים כדי ליצור את המכשירים (חיידקים חיישן) ואת הטכניקות האנליטיות כדי לבדוק את התפקוד של המכשירים ולנתח את אותות הזריחה שהתקבלו. הפרוטוקול כולל גם אוסף של ראיות משפטית בצורה של יד מנגב לאסוף GSR מידיהם של חשוד או שאיפה לאסוף את GSR מפני השטח. תוצאות מהתקן החיישן המוביל מוצגים כתוצאות לדוגמה, יחד עם הדגמה של בדיקה חיובית עבור GSR באמצעות מעטפת מחסנית בילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים ופתרון בעיות
ניתן לשנות את הניסוי המתואר בטבלה 4 בכל דרך המתאימה לחיישנים שעוצבו. ההיבט החשוב ביותר של החיישן הכימי הוא להעריך את רגישותו ואת הספציפיות. זה מועיל כדי להבטיח כי מגוון רחב של ריכוזים של האנליטה מנותח כדי לקבוע את מגוון אנליטי שימושי ש…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר את התלמידים באוניברסיטת Longwood ב BIOL 324 (גנטיקה) והסטודנטים בכימיה 403 (פתרון בעיה כימית מתקדמת מעבדה) אשר היו מעורבים הכנה הראשונית ובדיקות של אנטימון וחיישנים ביולוגיים עופרת. הרעיון של MicRoboCop היה שנוצר ב-GCAT SynBIO הסדנה (קיץ 2014), אשר ממומן על ידי NSF והווארד יוז המכון הרפואי מתארח על ידי אוניברסיטת מרילנד בבולטימור קאונטי. המחברים גם להכיר מימון שהתקבלו באוניברסיטת Longwood המכללה לאמנויות ומדעים ומענק GCAT SynBio בוגרים.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
Referenzen
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , (2016).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications – An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
