発砲残渣の推定検出のための新しい細菌性バイオセンサの調製と適用
Summary
合成生物学技術を用いて、銃創の分析のために一連の細菌用バイオセンサーを合成し、蛍光分光法を用いてその使用目的に対してデバイスの機能をテストするプロトコルを提示します。
Abstract
MicRoboCop は法医学化学の独特な適用のために設計されていたバイオセンサーである。MicRoboCop は3つの装置で構成されるシステムで、一緒に使用すると、3つの主要な検体 (アンチモン、鉛、および GSR の有機成分) の存在下で蛍光シグナルを生成することによって、発射残渣 (GSR) の存在を示すことができます。本プロトコルは、大腸菌 (e.coli) を用いたバイオセンサーの合成と、センサの選択性と感度を評価するために用いられる分析化学法について述べる。システムの機能は、使用済みカートリッジケーシングの内部から GSR を収集することによって実証されます。一度準備すれば、バイオセンサーは必要になるまで貯えることができ、これらの主要な分析物のためのテストとして使用することができる。3つの検体すべてからの肯定的な反応は、GSR に対する推定陽性試験を提供し、個々のデバイスは、他のサンプル中の検体を検出するためのアプリケーション (例えば、飲料水中の鉛汚染の検出器) を有する。システムの主な制限は、正の信号に必要な時間です。今後の研究は、応答時間を最適化するために異なる生物を研究することを含むかもしれない。
Introduction
バイオセンサは、化学物質または検体の検出に使用できる応答を生成する生物学的成分 (例えば、タンパク質、核酸、または生物全体) を使用する任意の分析装置です。例として、石炭鉱業は、有毒な鉱山ガスの存在を検出するために20世紀の多くのためにバイオセンサを使用しました: 炭鉱1のカナリア。生物の生物 (カナリア) は、化学物質 (一酸化炭素) への応答 (死または苦痛) を労働者を保護するために鉱夫によって観察されました。より現代的で洗練された例では、細菌は、蛍光タンパク質の発現のような特定の反応を示すことによって特定の化学分析物の存在に応答する合成生物学技術を使用して改変することができる。
合成生物学は、自然に存在しない生物学的デバイスやシステムの構築、または特定の目的のための既存の生物学的システムの再設計を指す広義の用語である2.合成生物学は、標準的な方法論と、デバイスやシステムの合成に使用できる標準化された部品(標準合成生物学の遺伝的要素) の存在によって、遺伝子工学とは区別される。ある部位は、細菌のような生物である装置のゲノムに導入され、機能の指標として役立つ特定の形質を発現する。例えば、多くの合成デバイスにおいて、蛍光タンパク質の発現は、レポータータンパク質として単細胞生物に導入される。複数のデバイスをシステムに結合することができます。細菌などの微生物のゲノムは、このように操作が容易です。様々な化学物質に特有のバイオセンサーの多くの例は、過去10年間の文献で報告されています3,4.
この研究では、MicRoboCop システムは、法医学および環境化学における新規アプリケーションと合成生物学技術を使用して設計されたバイオセンサの例として提示されています。MicRoboCop は3つの装置のシステムで、これを組み合わせることにより、ヒトの手や表面から採取された銃創 (GSR) によって、大腸菌が赤色蛍光タンパク質 (RFP) を発現することを可能にします。3つの装置の各々は、GSR5の構成要素であることが知られている特定の化学分析物に応答する。システムが応答する3つの分析対象は、I. 2, 4, 6-トリニトロトルエン (TNT) および関連化合物 II.鉛 (鉛イオンの形で)、および III.アンチモン (イオンの形態でも)。
GSR には多くの異なる化学物質が含まれていますが、主に GSR としての残渣を特定するために使用される3つは、バリウム、鉛、およびアンチモン5です。GSR の同定のための標準証拠試験は、エネルギー分散型 X 線蛍光 (EDX)5で走査電子顕微鏡 (SEM) を使用することである。SEM-BPS では、分析者が GSR の固有の形態および元素成分を特定することができます。現在、利用可能ないくつかの広く使用されているバイナリ推定試験があります。最近公表された推定試験の1つはイオンモビリティ分光法 (IMS) を使用しており、これは多くのラボ6では利用できないかもしれない特殊な装置です。また、使用できる色の「スポット」テストもいくつかありますが、通常は距離の決定や、弾丸穴や創傷5の GSR の識別に使用されます。さらに、ボルタンメトリー分析を使用する GSR のための電気化学試験に関する文献の一部には限定的な注意が払われており、これは潜在的に移植可能なフィールド、または陽極ストリッピングボルタンメトリーの利点があり、これは非常に金属元素の敏感な方法7.GSR を検出する目的のために特別に設計されたバイオセンサーの文献にはほとんど言及されていませんが、他の法医学アプリケーション用の一部のバイオセンサーは8を公開しています。
MicRoboCop システムにおける各デバイスの生物学的要素と、プラスミドの構造について、図 1に示します。図 1bにおいて湾曲した矢印は、検体の存在下で活性化されるプロモーター領域を表し、その楕円形は、レポータータンパク質の翻訳を可能にするリボソーム結合部位であり、RFP とラベル付けされた灰色のボックスは赤色を発現する遺伝子である蛍光タンパク質、および赤色八角形は転写終結部位である。3つのデバイスはすべて、GSR を検出するシステムとして一緒に使用されます。特定のプロモーター (SbRFP、PbRFP、TNT-RFP) を持つ各デバイスは、試験中のサンプルと共にインキュベートされ、RFP の蛍光が測定されます。RFP は、適切な化学物質が存在し、プロモーター領域を活性化する場合にのみ表現されます。GSR に存在する化学物質のいくつかに応答する3つのデバイスが設計されており、この作業で紹介しています。
3つの MicRoboCop デバイスで使用されるプロモーターは、ヒ素およびアンチモン感受性プロモーター、 SbRFP9、10、鉛感受性プロモーター、 PbRFP11、12および TNT 高感度プロモーター、TNT-RFP文献の検索は、バリウムに応答するように設計されたプロモーターを明らかにしなかったので、このプロモーターは、多くの構造的に関連する化合物 (特に、2, 4-dinitrotoluene およびdinitrobenzene) は、GSR に取り残された有機化合物の一部であることが知られている。このプロモーターは、埋設された地雷13における微小な量の TNT および 2, 4-dinitrotoluene (2, 4 DNT) を特異的に検出するために首尾よく用いられる。3つの装置をシステムとして一緒に使用すると、GSR のポジティブ・テストにより、3つのデバイスすべてに蛍光が生成されます。1つまたは2つの装置のみでの蛍光シグナルは、検体の別の環境源 (複数可)、または TNT プロモーターの場合、GSR において有機化合物が残されていない化合物による活性化を示す。すべての3つのデバイスを一緒に使用することにより、環境情報源による偽陽性の結果の可能性が最小限に抑えられます。人気が高まっている無鉛弾薬は、米国での弾薬販売量の約 5% しか占めていない。したがって、鉛が存在しないことによる偽陰性の結果は可能性があるが、GSR14のマーカーとしてリードを使用するセンサーには依然として有用性があります。この特定のフォレンジックアプリケーションに加えて、各デバイスは、環境汚染物質を検出する目的のために別々に使用することができます。
提示されたプロトコールには、デバイス (センサ細菌) を作成するために用いられる合成生物学技術と、デバイスの機能をチェックし得た蛍光シグナルを分析する分析技術が含まれる。プロトコルはまた、表面から GSR を収集するために、容疑者やスワブの手から GSR を収集するための手の拭き取りの形で法医学証拠の収集が含まれています。リードセンサー装置からの結果は、サンプル結果として、使用済みカートリッジケーシングを用いた GSR に対するポジティブテストのデモンストレーションとともに提示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
修正とトラブルシューティング
表 4に記載した実験は、設計されたセンサに適切な任意の方法で修正することができる。化学センサーの最も重要な側面は、その感度と特異性を評価することです。センサの有用な分析範囲を決定するために、検体の濃度の広い範囲が分析されることを確実にすることが有益である。また、細胞のための検体の最?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は BIOL 324 (遺伝学) と、アンチモンおよび鉛バイオセンサーの初期準備と試験に関与していた化学 403 (高度化学実験問題解決) の学生である、ロングウッド大学の学生を認めたいと思います。MicRoboCop のためのアイデアは、NSF とハワード・ヒューズ医学研究所によって資金を提供し、メリーランド大学ボルチモア郡によってホストされている GCAT SynBIO ワークショップ (夏の 2014) で構想されました。また、ロングウッド大学のクック・コール・カレッジ・オブ・アーツ・アンド・サイエンスと GCAT SynBio 同窓会の助成金も受領しています。
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
Referenzen
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