Preparazione e applicazione di un nuovo biosensore batterico per il rilevamento presuntivo di residui di arma da fuoco
Summary
Un protocollo è presentato utilizzando tecniche di biologia sintetica per sintetizzare una serie di biosensori batterici per l’analisi dei residui di arma da fuoco, e per testare il funzionamento dei dispositivi per il loro uso previsto utilizzando la spettroscopia a fluorescenza.
Abstract
MicRoboCop è un biosensore che è stato progettato per un’applicazione unica nella chimica forense. MicRoboCop è un sistema costituito da tre dispositivi che, se utilizzati insieme, possono indicare la presenza di residui di arma da fuoco (GSR) producendo un segnale di fluorescenza in presenza di tre analiti chiave (antimonio, piombo e componenti organici di GSR). Il protocollo descrive la sintesi dei biosensori che utilizzano Escherichia coli (e. coli) e i metodi di chimica analitica utilizzati per valutare la selettività e la sensibilità dei sensori. Il funzionamento del sistema è dimostrato utilizzando GSR raccolti dall’interno di un involucro cartuccia esaurito. Una volta preparati, i biosensori possono essere conservati fino a quando necessario e possono essere utilizzati come test per questi analiti chiave. Una risposta positiva da tutti e tre gli analiti fornisce un test positivo presuntivo per GSR, mentre ogni singolo dispositivo ha applicazioni per rilevare gli analiti in altri campioni (ad esempio, un rivelatore per la contaminazione del piombo nell’acqua potabile). La limitazione principale del sistema è il tempo necessario per un segnale positivo; lavoro futuro può comportare lo studio di diversi organismi per ottimizzare il tempo di risposta.
Introduction
Un biosensore è qualsiasi dispositivo analitico che utilizza componenti biologici (come proteine, acidi nucleici o interi organismi) che producono una risposta che può essere utilizzata per il rilevamento di una sostanza chimica o di un analita. Ad esempio, l’industria mineraria del carbone ha utilizzato un biosensore per gran parte del 20° secolo per rilevare la presenza di gas minerari tossici: il canarino nella miniera di carbone1. La risposta dell’organismo biologico (canarino) (morte o angoscia) ad un analita chimico (monossido di carbonio) è stata osservata dai minatori al fine di proteggere i lavoratori. In un esempio più moderno e sofisticato, i batteri possono essere alterati utilizzando tecniche di biologia sintetica per rispondere alla presenza di un determinato analita chimico esibendo una risposta specifica, come l’espressione di una proteina fluorescente.
La biologia sintetica è un termine generico che si riferisce alla costruzione di dispositivi biologici e sistemi che non esistono naturalmente, o la riprogettazione di sistemi biologici esistenti per uno scopo specifico2. La biologia sintetica si distingue dall’ingegneria genetica da una metodologia standard e dall’esistenza di parti standardizzate (elementi genetici di biologia sintetica standard) che possono essere utilizzati per sintetizzare dispositivi e sistemi. Una parte viene introdotta nel genoma di un dispositivo, un organismo come un batterio, per esprimere un certo tratto che servirà come indicazione di funzione. Ad esempio, in molti dispositivi sintetici, l’espressione di una proteina fluorescente viene introdotta in un singolo organismo cellato come proteina reporter. È possibile combinare più dispositivi in un sistema. I Geniti di microrganismi come i batteri sono facili da manipolare in questo modo. Numerosi esempi di biosensori specifici per una vasta gamma di analiti chimici sono stati riportati in letteratura negli ultimi dieci anni,3,4.
In questo lavoro, il sistema MicRoboCop è presentato come un esempio di un biosensore progettato utilizzando tecniche di biologia sintetica con nuove applicazioni in chimica forense e ambientale. MicRoboCop è un sistema di tre dispositivi separati che, quando combinati, permetteranno a Escherichia coli di esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP) in presenza di residui di arma da fuoco (GSR) che sono stati raccolti dalle mani di una persona o da una superficie. Ciascuno dei tre dispositivi risponde a uno specifico analita chimico che è noto per essere un componente di GSR5. I tre analiti a cui il sistema risponde sono I. 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) e i relativi composti, II. piombo (sotto forma di ioni di piombo), e III. antimonio (anche sotto forma di ioni).
GSR è costituito da molte sostanze chimiche diverse, ma i tre di solito utilizzati per identificare un residuo come GSR sono bario, piombo, e antimonio5. Il test probatorio standard per l’identificazione di GSR consiste nell’utilizzare la microscopia elettronica a scansione (SEM) con fluorescenza a raggi X a dispersione di energia (EDX)5. SEM-EDX consente agli analisti di identificare la morfologia unica e i componenti elementali di GSR. Attualmente, ci sono pochi ampiamente utilizzati test presuntivi binari disponibili. Un test presuntivo recentemente pubblicato utilizza la spettroscopia di mobilità ionica (IMS), che è un’apparecchiatura specializzata che potrebbe non essere disponibile in molti laboratori6. Ci sono anche alcuni test di colore “spot” che possono essere utilizzati, anche se sono tipicamente utilizzati per la determinazione della distanza o per l’identificazione GSR su fori di proiettile e ferite5. Inoltre, c’è stata una certa attenzione limitata nella letteratura per i test elettrochimici per GSR che impiegano l’analisi voltammetrica, che ha il vantaggio di essere potenzialmente in campo portatile, o anodico stripping voltammetria, che è un estremamente Metodo sensibile per gli elementi metallici7. Nella letteratura dei biosensori progettati specificamente allo scopo di rilevare la GSR è molto poca menzione, anche se alcuni biosensori per altre applicazioni forensi sono stati pubblicati8.
Gli elementi biologici per ogni dispositivo nel sistema MicRoboCop, e la costruzione del plasmide, sono illustrati in Figura 1. La freccia curva in Figura 1B rappresenta la regione promotrice che viene attivata in presenza dell’analita, l’ovale è il sito di legame ribosomiale che permette la traduzione della proteina reporter, la scatola grigia etichettata RFP è il gene che esprime il rosso proteina fluorescente, e l’ottagione rosso è il sito di terminazione della trascrizione. Tutti e tre i dispositivi saranno utilizzati insieme come un sistema per rilevare GSR. Ogni dispositivo con un promotore specifico (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) sarà incubato con il campione che viene testato e la fluorescenza di RFP sarà misurata. La RFP sarà espressa solo se l’analita chimico appropriato è presente e attiva la regione promotrice. Tre dispositivi che rispondono ad alcune delle sostanze chimiche presenti in GSR sono stati progettati e sono presentati in questo lavoro.
I promotori utilizzati nei tre dispositivi microbocop sono un promotore sensibile all’arsenico e all’antimonio , sbrfp9,10, un promotore sensibile al piombo, pbrfp11,12 e un promotore sensibile al TNT, TNT-RFP 13. poiché una ricerca in letteratura non ha rivelato alcun promotore progettato per rispondere al bario, il promotore di TNT è stato selezionato invece poiché questo promotore è sensibile a una serie di composti strutturalmente correlati (in particolare, 2, 4-dinitrotoluene e dinitrobenzene) che sono noti per essere una parte dei composti organici lasciati alle spalle in GSR. Questo promotore è stato utilizzato con successo per rilevare in modo specifico quantità minute di TNT e di 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) nelle miniere di terra sepolte13. Utilizzando i tre dispositivi insieme come un sistema, un test positivo per GSR produrrà fluorescenza in tutti e tre i dispositivi. Un segnale di fluorescenza in uno o due dispositivi indicherà un’altra fonte ambientale dell’analita (s) o nel caso del promotore di TNT, l’attivazione da parte di un composto che non è un composto organico lasciato alle spalle in GSR. Utilizzando tutti e tre i dispositivi insieme, la possibilità di un risultato falso positivo a causa di fonti ambientali è minimizzata. Le munizioni prive di piombo, che stanno guadagnando popolarità, rappresentano ancora solo il 5% delle vendite di munizioni negli Stati Uniti; quindi, risultati falsi negativi a causa dell’assenza di piombo può essere una possibilità, ma c’è ancora utilità in un sensore che utilizza il piombo come un marcatore per GSR14. Oltre a questa specifica applicazione forense, ogni dispositivo può essere utilizzato separatamente per individuare i contaminanti ambientali.
I protocolli presentati includono le tecniche di biologia sintetica utilizzate per creare i dispositivi (batteri del sensore) e le tecniche analitiche per controllare la funzione dei dispositivi e analizzare i segnali di fluorescenza ottenuti. Il protocollo include anche la raccolta di prove forensi sotto forma di pulizia a mano per raccogliere GSR dalle mani di un sospetto o di un tampone per raccogliere GSR da una superficie. I risultati del dispositivo con sensore di piombo sono presentati come risultati di esempio, insieme a una dimostrazione di un test positivo per GSR utilizzando un involucro cartuccia esaurito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifiche e risoluzione dei problemi
L’esperimento descritto nella tabella 4 può essere modificato in qualsiasi modo appropriato ai sensori che sono stati progettati. L’aspetto più importante di un sensore chimico è quello di valutarne la sensibilità e la specificità. È utile garantire che un’ampia gamma di concentrazioni dell’analita venga analizzata per determinare l’utile intervallo analitico del sensore. Vale anche la pena di determinare un livello m…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere gli studenti della Longwood University in BIOL 324 (genetica) e gli studenti di CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory problem solving) che sono stati coinvolti nella preparazione iniziale e nel collaudo dei biosensori antimonio e piombo. L’idea di MicRoboCop è stata concepita presso il workshop GCAT SynBIO (Summer 2014), finanziato dalla NSF e dall’Howard Hughes Medical Institute e ospitato dall’Università del Maryland Contea di Baltimora. Gli autori riconoscono anche i finanziamenti ricevuti dal Cook-Cole College delle arti e delle scienze di Longwood University e dal GCAT SynBio Alumni Grant.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
Referenzen
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