小鼠肝外胆管有机体的产生
Summary
该方案描述了小鼠肝外胆管三维器官系统的产生。这些胆道有机物质可以维持在培养中, 以研究胆管细胞生物学。胆道有机体表达的标志物的祖先和胆道细胞, 是由偏振上皮细胞。
Abstract
胆管病变, 影响肝外胆管 (Ehbd), 包括胆道闭锁, 原发性硬化性胆管炎, 和胆管癌。他们没有有效的治疗选择。研究 EHBD 的工具非常有限。我们的目的是开发一种特定于器官、多才多艺的成人干细胞衍生的、临床前的胆管细胞模型, 该模型可从野生小鼠和基因工程小鼠中轻松生成。因此, 我们报告了从成年小鼠 Ehbd 中开发 EHBD 有机体 (EHBDO) 培养系统的新技术。该模型具有成本效益, 能够轻松进行分析, 并具有多个下游应用。具体而言, 我们描述了小鼠 EHBD 分离和单细胞离解、有机体培养的启动、繁殖以及长期维护和储存的方法。本文还介绍了 EHBDO 的免疫组织化学、荧光显微镜和 mRNA 丰度定量的实时定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR)。该协议除了生产 ehbd 特异性有机体外, 还具有显著的优势。使用来自 L-WRN 细胞的条件介质可显著降低该模型的成本。与人体组织不同, 小鼠 Ehbd 的使用为培养生成提供了几乎无限的组织。生成的小鼠 Ehbdo 含有纯群体的上皮细胞, 具有内皮祖细胞和分化胆道细胞的标记。培养的有机生物通过多个通道保持均匀形态, 并可在液氮长期储存后恢复。该模型允许研究胆道祖细胞增殖, 可以在药理上操纵, 也可以从基因工程小鼠中产生。需要进行进一步的研究, 以优化培养条件, 以提高电镀效率, 评估功能细胞成熟度, 并直接分化细胞。开发共培养模型和更中性的细胞外基质也是可取的。
Introduction
胆管病变是一种不治之症, 影响位于肝内和肝外胆管 (Ehbd)的胆道细胞1。一些胆管疾病, 如原发性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道闭锁和胆总管囊肿, 主要影响乙二苯醚。由于临床前模型有限, 胆管病治疗的发展受到限制。此外, 以前的研究侧重于分类的胆管疾病: 肝脏、肝内和乙二苯醚。然而, 内和乙二苯醚具有明显的胚胎起源, 因此, 应被视为不同的分子病理。肝内胆管从肝内导管板和肝室的颅骨部分发展, 整个 EHBDs 从肝室2的尾部发育.他们还依靠不同的祖细胞隔间进行成人稳态, 包括 ehbd2,3中肝内胆管和胆道周围的海灵管。使用动物模型进行临床前研究受到费用的限制, 出于伦理原因, 应尽量减少。因此, 在体外模型中, 还原性、重现性、时间和成本效益是非常可取的。
以前对胆管病变的大多数研究都使用了正常的小鼠或大鼠癌症模型, 或来自乙二苯并 4、5、6、7的人胆管癌细胞系.然而, 这些都是转化细胞的模型, 并不重述正常的胆管细胞生物学在稳态或处于健康状态。最近在发展的有机型培养模型的进展, 使三维结构的发展, 从不同的组织类型, 包括肝胆组织, 虽然不是正常的小鼠 ehbd8,9, 10个。这些 “器官样” 结构旨在模仿原代组织, 生长在一个人工生态位, 支持器官特异性干细胞的自我更新, 11。
“有机体” 是一个宽泛的术语, 通常描述从干细胞中获得的三维组织模型。有机体可以从胚胎干细胞和诱导多能干细胞所代表的重新编程的多能干细胞中产生。它们也可以从器官特异性的成人干细胞12中产生。在以往的研究中, 已经提出了一些胆管细胞有机体模型。因此, 从人类多能干细胞中提取的有机生物已被报道为7、9、13, 并提供了一个宝贵的、时间高效的工具, 可以同时生成不同的细胞类型。然而, 这些多能干细胞衍生的有机体并不能完全反映原发性成人 EHBD 胆管细胞的结构和功能。
还提出了从人9和猫10肝的成虫干细胞中提取的有机体。猫科车型并不普遍, 用于研究目的的工具设备有限。此外, 这些肝源性成人干细胞衍生的有机体不模拟肝外胆管细胞, 而是肝内胆管细胞。
人类正常 Ehbd14和小鼠 ehbd 胆管癌15报告了 EHBD 有机体的产生。然而, 获得人类 EHBD 组织的机会极为有限, 从胆管癌的遗传小鼠模型15中获得的有机物质并不代表体内的健康胆管细胞生物学, 而是来自基因修饰细胞。
为了解决多能干细胞和肝脏衍生的胆管细胞组织模型的局限性以及临床前模型所需的对人体组织的访问有限的问题, 我们开发了一个小鼠 EHBD 有机体模型 (图 1a)。这份手稿描述了一种从成人组织中提取的小鼠 ehbd 衍生的有机体技术的发展。这些名为 Ehbdo 的 EHBD 有机体将是研究 Ehbd 胆管局稳态和疾病过程 (如胆管病变) 机制的重要体外工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
这项工作描述了小鼠 EHBD 胆管细胞的组织型三维模型的产生。EHBDO 培养过程中的重要步骤包括: 细致的 EHBD 解剖, 以避免胰腺细胞污染, 维护无菌条件, 以防止细菌和真菌污染, 以及离心后的精心操作, 以避免细胞材料的丢失。需要密切坚持所描述的温度条件。该技术存在一些限制。成年小鼠的乙二苯醚较小 (直径约1毫米;图 1e), 需要很巧妙的隔离。解剖显微镜可以用来协助解剖…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国肝病研究协会 (致 n. r.) 和国家卫生研究院、国家糖尿病和消化系统和肾脏疾病研究所 (p30 DK34933 颁发给 n. r.、P01 DK062041 至 j. l. m.) 的支持。我们感谢 Ramon Oacadiz-ruiz 博士 (密歇根大学) 协助制定这一方法。
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
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