マウス肝外胆管からオルガノイドの生成
Summary
このプロトコルでは、マウス肝外胆管内 3 次元におけるシステムの運用について説明します。これらの肝オルガノイド cholangiocyte 生物を勉強する文化で維持できます。胆道 organoids 前駆細胞と胆管細胞のマーカーの表現し、偏光の上皮細胞で構成されています。
Abstract
胆道閉鎖症、原発性硬化性胆管炎、胆管癌、肝外胆管 (EHBDs) に影響を与える、Cholangiopathies が含まれます。彼らは効果的な治療オプションであるないです。EHBD を検討するためのツールは非常に制限されます。私たちの目的は、野生型および遺伝子改変マウスから簡単に生成することができます臓器特異、汎用性の高い、大人の幹細胞、臨床 cholangiocyte モデルを開発することでした。したがって、成体マウス EHBDs から EHBD (EHBDO) における文化システムの開発手法について報告する.モデルはコスト効率の高い、容易に分析することができる複数のダウン ストリーム アプリケーションであり。具体的には、マウスの EHBD 分離と単一細胞解離、organoid 文化発生, 伝ぱと長期的な保守とストレージの方法論について述べる。この原稿には、リアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) による免疫組織化学、蛍光顕微鏡および mRNA 豊富な定量処理 EHBDO もについて説明します。このプロトコルには、EHBD 固有オルガノイドを生産に加えて重要な利点があります。L 警告細胞馴化培地の使用このモデルのコストを大幅に削減します。EHBDs ・ マウスの使用は、人間の組織とは異なり、文化世代のほぼ無制限の組織を提供します。生成されたマウス EHBDOs 内皮前駆細胞のマーカーと上皮細胞の純粋な人口を含めるし、胆管細胞を分化します。オルガノイド培養は複数の通路を通って同種の形態を維持し、液体窒素で長期保管後回復することができます。モデル肝前駆細胞増殖に関する研究では、薬理学的、操作することができます、遺伝子組み換えマウスから生成される可能性があります。将来の研究は、めっき効率を高める機能を細胞の成熟と分化の直接評価するために培養条件を最適化するために必要です。共培養モデルともっと生物学的に中立的な細胞外マトリックスの開発も目指しています。
Introduction
Cholangiopathies は、内・肝外胆管 (EHBDs)1に位置する胆管細胞に影響を与える難病の慢性進行性疾患です。原発性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道閉鎖症と総胆管の嚢胞のようないくつかの cholangiopathies は、EHBDs を主に影響します。Cholangiopathies 治療法の開発は、前臨床モデルの限られた供給によって制限されます。さらに、先行研究をまとめ cholangiopathies に焦点を当て: 肝臓、内および EHBDs。しかし、内 EHBDs 異なる胚起源を持っているし、したがって、異なる分子病態として考慮されるべき。肝内胆管は、肝膵板と肝憩室の頭蓋の一部から開発、肝憩室2の尾の部分から全体の EHBDs を開発します。彼らはまた、肝内胆管と EHBDs2,3の後腺ヘリングの運河を含む大人の恒常性の異なる前駆細胞コンパートメントに依存します。前臨床研究のための動物モデルの使用費用によって制限され、倫理的な理由のため最小限に抑える必要があります。したがって、還元、再現性のある、時間およびコスト効率の高い体外モデルは非常に望ましいです。
Cholangiopathies のほとんどの先行研究では、正常マウスまたはラット癌モデルまたは EHBDs4,5,6,7からひと胆管癌細胞の増殖を利用されています。ただし、これらは変換されたセルのモデルであり、通常 cholangiocyte 生物の恒常性や健康状態を再現できません。切片培養モデルの開発の最近の進展は、正常ではないマウス EHBDs8,9、肝胆道系組織を含む、異なる組織タイプから 3 次元構造の開発を許可しています。 10。これらの「オルガンのような”構造は主な組織模倣目的し、11臓器特異幹/前駆細胞の自己複製を支援人工ニッチで栽培されて。
「Organoid」は広範な言葉それほとんど一般幹細胞由来三次元組織モデルをについて説明します。オルガノイドをプログラムし直された多能性幹細胞は胚性幹細胞で表され、誘導多能性幹細胞から生成できます。彼らはまた臓器特異成体幹細胞12から生成できます。いくつかの cholangiocyte におけるモデルは、以前の研究で提案されている.したがって、ひと多能性幹細胞由来 organoids 報告7,9,13をされている、異なる種類の細胞を同時生成できる、貴重な時間の効率的なツールを提供します。ただし、構造と機能の主なアダルト EHBD 胆管に、完全に、これら多能性幹細胞由来 organoids は反映されません。
9の人間の成人の幹細胞から派生したオルガノイドとネコ10肝はまた提案しました。猫のモデルは広く利用可能ではないと研究用ツール装備一式が限られています。また、これら肝臓由来成人幹細胞オルガノイドむしろ肝内胆管、肝外胆管にモデル化を行います。
EHBD organoid 世代は人間普通 EHBDs14マウス EHBD 肝門部胆管癌の15から報告されました。EHBD 人体へのアクセスは非常に限られた organoids に由来する胆管細胞癌15の遺伝的マウスモデルは恒常性の生物学の健康的な cholangiocyte ではないし、遺伝子組換え細胞由来します。
多能性幹細胞と肝臓由来 cholangiocyte organoid モデルおよび前臨床モデルで必要とされる人間の組織への限られたアクセスの制限に対処するには、マウス EHBD organoid モデル (図 1 a) を開発しました。本稿では、マウス成体組織から EHBD 派生オルガノイドの技術の開発について説明します。EHBDOs の名前これら EHBD オルガノイド EHBDs cholangiocyte の恒常性と病気プロセス、cholangiopathies などの基になるメカニズムの研究のための重要な生体外のツールになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この作品では、マウス EHBD 胆管の切片 3次元モデルの生成について説明します。EHBDO 文化世代の重要なステップは、膵臓細胞汚染、細菌および真菌の汚染と遠心分離を避けるために後慎重に操作を防ぐために滅菌条件の整備を避けるため細心の EHBD 郭清、細胞材料の損失。記載されている温度条件との密着が必要です。手法にいくつかの制限があります。成体マウスの EHBDs、小さな (約 1 mm の…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アメリカ協会 (ノーマン ・) に研究の肝疾患ピナクル賞、国立衛生研究所、国立糖尿病、消化器・腎臓病 (ノーマン ・ J.L.M. に影響するもの P01 DK062041 に P30 DK34933 賞受賞) によって支えられました。この方法論の開発と彼の援助ありがとう博士ラモン Ocadiz-ルイス (ミシガン大学)。
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
Referenzen
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113 (2018).
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction – Are Biomaterials Dispensable?. Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
