Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón
Summary
Este protocolo describe la producción de un sistema de 3 dimensiones organoide ratón vía biliar extrahepática. Estos organoides biliares se pueden mantener en cultivo a estudiar biología de cholangiocyte. Organoides biliares expresan marcadores de progenitoras y células biliares y están compuestas de células epiteliales polarizadas.
Abstract
Cholangiopathies, que afectan a los conductos biliares extrahepáticos (EHBDs), incluyen la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria y colangiocarcinoma. No tienen ninguna opciones terapéuticas eficaces. Herramientas para el estudio de EHBD son muy limitadas. Nuestro propósito fue desarrollar un modelo de cholangiocyte preclínicos, derivadas de células madre órgano-específicas, versátil, adultos que se puede generar fácilmente de tipo salvaje y de ratones modificados genéticamente. Así, nos informe sobre la nueva técnica de desarrollo de un sistema de cultivo de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de ratón adulto. El modelo es costo-eficiente, capaz de ser analizado fácilmente, y tiene múltiples usos aguas abajo. Específicamente, se describe la metodología de aislamiento de EHBD de ratón y disociación unicelular, organoide cultura iniciación, propagación y mantenimiento a largo plazo y almacenamiento. Este manuscrito también describe EHBDO procesamiento por inmunohistoquímica, microscopía fluorescente y cuantificación de abundancia del mRNA por reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo tiene ventajas significativas además de producir organoides específicos EHBD. El uso de un medio condicionado de las células L-AVS reduce significativamente el costo de este modelo. El uso del ratón EHBDs proporciona tejido casi ilimitado para la generación de cultura, a diferencia de los tejidos humanos. EHBDOs ratón generados contienen una población pura de células epiteliales con marcadores del progenitor endodérmico y biliares células diferenciadas. Organoides cultivadas mantienen morfología homogénea a través de múltiples pasos y pueden ser recuperados después de un período de almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. El modelo permite el estudio de la proliferación celular biliar del progenitor, se puede manipular farmacológicamente y puede generarse a partir de ratones modificados genéticamente. Se necesitan futuros estudios para optimizar las condiciones de cultivo con el fin de aumentar la eficiencia de la galjanoplastia, evaluar la madurez funcional de la célula y diferenciación celular directa. Desarrollo de modelos de co-cultivo y una matriz extracelular biológicamente más neutral son también deseables.
Introduction
Cholangiopathies son incurables crónica trastornos progresivos que afectan las células biliares en intra y conductos biliares extrahepáticos (EHBDs)1. Algunos cholangiopathies, como colangitis primaria esclerosante, colangiocarcinoma, atresia biliar y quistes coledocales, afectan predominante a EHBDs. Desarrollo de terapias de cholangiopathies está restringida por la limitada disponibilidad de modelos preclínicos. Además, estudios previos enfocados cholangiopathies agrupados: hígado, intra y EHBDs. Sin embargo, intra – y EHBDs tienen un origen embrionario distinto y, por lo tanto, deben considerarse como patologías moleculares distintas. Conductos biliares intrahepáticos se convierten de las placas ductales intrahepáticas y la parte craneal del divertículo hepático, todo EHBDs se convierten de la parte caudal del divertículo hepático2. También cuentan con compartimientos de célula progenitora diferente para homeostasis del adulto, incluyendo los canales de Hering en conductos biliares intrahepáticos y glándulas peribiliary en EHBDs2,3. Uso de modelos animales para estudios preclínicos es limitado por gastos y debe reducirse al mínimo por razones éticas. Por lo tanto, reduccionista, tiempo, reproducible y costo-eficientes modelos in vitro son altamente deseables.
Mayoría de los estudios previa de cholangiopathies utilizados normal del ratón o rata cáncer modelos o colangiocarcinoma humana líneas de células derivadas de intra – y EHBDs4,5,6,7. Sin embargo, estos son los modelos de las células transformadas y no recapitular cholangiocyte normal biología en homeostasis o en un estado saludable. Recientes avances en el desarrollo de modelos de cultura organotypic ha permitido el desarrollo de estructuras 3-dimensionales de tipos de diferentes tejidos, incluyendo tejidos Hepatobiliar, aunque no normal del ratón EHBDs8,9, 10. Estos “órganos” estructuras destinadas a mímico primario del tejido y se cultivan en un nicho artificial apoyando la auto-renovación de las células progenitoras de órgano-específica11.
“Organoide” es un amplio término que más comúnmente se describe modelos de 3 dimensiones del tejido derivados de células madre. Organoides pueden generarse de reprogramadas pluripotentes células madre había representada por las células madre embrionarias e inducida por células madre pluripotentes. También puede generarse a partir de las células madre órgano-específicas12. Se han propuesto algunos modelos de organoide de cholangiocyte en anteriores estudios. Así, organoides derivados de células madre pluripotentes humanas han sido reportados7,9,13 y proporcionan una herramienta eficiente de valioso, tiempo que permite la generación simultánea de diferentes tipos de células. Sin embargo, estos organoides derivados de células madre pluripotentes no reflejan plenamente la estructura y funcionalidad de primaria adultos cholangiocytes EHBD.
Organoides derivan de las células madre adultas de la humana9 y felino10 hígado también fueron propuestos. Modelos felinos no están ampliamente disponibles y tienen un limitado arsenal de herramienta para fines de estudio. Por otra parte, estos organoides de derivados de células madre adultas de derivados hígado no modelo cholangiocytes extrahepática pero cholangiocytes algo intrahepática.
Generación de organoide EHBD informó de humano normal EHBDs14 y ratón EHBD colangiocarcinoma15. Sin embargo, acceso a tejido EHBD humano es extremadamente limitado, y organoides derivados de un modelo murino genético de colangiocarcinoma15 no representan biología de cholangiocyte saludable en homeostasis y se derivan de las células genéticamente modificadas.
Para hacer frente a las limitaciones de pluripotent derivadas de células madre y hígado cholangiocyte organoide modelos y el acceso limitado a los tejidos humanos en modelos preclínicos, hemos desarrollado un modelo murino de organoide EHBD (figura 1A). Este manuscrito describe el desarrollo de una técnica para ratón organitas EHBD derivadas de tejido adulto. Estos organoides EHBD llamados EHBDOs será una importante herramienta en vitro para el estudio de los mecanismos subyacentes a EHBDs cholangiocyte homeostasis y enfermedad procesos como cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe la generación de un modelo de 3 dimensiones organotypic de ratón cholangiocytes EHBD. Pasos importantes en la generación de cultura EHBDO incluyen la disección meticulosa de EHBD para evitar la contaminación de células de páncreas, mantenimiento de condiciones estériles para evitar la contaminación bacteriana y fúngica y manipulación cuidadosa después de la centrifugación para evitar la pérdida de material celular. Se requiere una adhesión estrecha a las condiciones de temperatura des…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana para el estudio del hígado enfermedades Pinnacle Premio (N.R.) y los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (premios DK34933 P30 a N.R., DK062041 P01 a J.L.M.). Agradecemos al Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Universidad de Michigan) por su ayuda con el desarrollo de esta metodología.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
Referenzen
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