מלכודת droplet דיגיטלית (ddTRAP): הסתגלות פרוטוקול Telomere חזרה הגברה על תגובת שרשרת התגובה של רביב דיגיטלי
Summary
הצלחנו להמיר בהצלחה את התקן טלומר חוזר פרוטוקול (מלכודת) האפשרות להיות מועסק בתגובות שרשרת droplet דיגיטלית פולימראז. שיטת הפעולה החדשה, הנקראת ddtrap, רגישה יותר וכמותית, ומאפשרת זיהוי טוב יותר וניתוח סטטיסטי של פעילות טלומראז בתוך תאים אנושיים שונים.
Abstract
הפרוטוקול של הגברה חוזרת של טלומר (TRAP) הוא הדבר הנפוץ ביותר לזיהוי פעילות טלומר בתוך מדגם נתון. השיטה המבוססת על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מאפשרת מדידות איתנות של פעילות אנזימים ממרבית תאי התאים. המלכודת המבוססת על ג’ל עם התווית התחל מגבילה את התפוקה לדוגמה, והיכולת לזהות הבדלים בדגימות מוגבלת לשני שינויים מתקפל או גדולים יותר בפעילות האנזים. המלכודת ה-droplet הדיגיטלית, ddTRAP, היא גישה רגישה מאוד ששונתה מתוך מבנה המלכודת המסורתי, מה שמאפשר למשתמש לבצע ניתוח מעמיק על 96 דגימות לכל הפעלה ולהשיג קוונפיקציה מוחלטת של ה-DNA (telomerase מוצרים הרחבה ) בתוך כל ה-PCR. לכן, שיטת ddtrap שפותחה לאחרונה גוברת על המגבלות של שיטת ההשמנה המסורתית ג’ל מבוססת ומספקת גישה יעילה יותר, מדויקת וכמותית למדידת פעילות טלומראז בתוך המעבדה והגדרות קליניות.
Introduction
טלומרים הם מתחמי DNA-פרוטאין דינמיים בקצות כרומוזומים ליניאריים. טלומרים אנושיים מורכבים ממערך של 5 ‘-TTAGGGn hexameric חוזר אשר משתנה באורך בין 12 – 15 קילו (kb) בלידה1. מחיקת האדם, האנזים הריבונאופלפרוטאין השומר על הטלומרים, זוהה לראשונה ב-“הלה תאי” (קו תאי סרטן)2. יחד, טלומרים ו טלומרים לשחק תפקיד מרכזי בספקטרום של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת הגנום, תקנות גנים, סרטן תאים אלמוות3,4,5,6.
האדם טלומראז מורכב בעיקר של שני מרכיבים מרכזיים, כלומר טלומראז הפוכה הטרנסקריפטאז ו טלומראז RNA (htert ו htert, בהתאמה). החלבון התחתי, htert, הוא מרכיב הפוכה פעיל היפוך הטרנססקריפט של האנזים טלומראז. תבנית RNA, hterc, מספקת טלומראז עם התבנית כדי להרחיב ו/או לשמור טלומראז. לרוב הרקמות הגופניות האנושיות אין פעילות מוחקת. חוסר היכולת של דנ א פולימראז להאריך את סופו של בפיגור של ה-dna יחד עם חוסר של טלומראז מוביל את הקיצור המתקדם של טלומראז לאחר כל סיבוב של החטיבה התאית. תופעות אלו מובילות לקיצור ברוב התאים הסומטיים עד שהם מגיעים לאורך מקוצר ביקורתי, לפיו תאים נכנסים למצב של הזדקנות מחודשת. המספר המקסימלי של פעמים תא יכול לחלק מוכתב על ידי האורך שלה טלומר ובלוק זה להמשך החטיבה התא הוא חשב למנוע התקדמות אונגנזה7. תאים סרטניים מסוגלים להתגבר על הזדקנות המושרה telomere ולהמשיך להתרבות על ידי ניצול telomere כדי לשמור על telomere שלהם. כ 90% של סרטן להפעיל טלומראז, מה שהופך פעילות טלומראז חשוב באופן ביקורתי בזיהוי וטיפול בסרטן.
ההתפתחות של שיטת המלכודת בשנות ה-90 הייתה אינסטרומנטלית בזיהוי המרכיבים הנחוצים של האנזים הטלומראז, כמו גם למדידת היקף התאים והרקמות, הן נורמליות והן סרטניים. שיטת ה-PCR המקורית המבוססת על ג’ל השתמשה ברדיוגנטית מתייגת מצעים DNA כדי לזהות פעילות טלומראז. בשנת 2006, העיבוד הותאם לצורה לא רדיואקטיבית באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים8,9. באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים, המשתמשים הצליחו להמחיש את מוצרי ההרחבה טלומראז כמו להקות על ג’ל על ידי חשיפת אותו גל עירור הנכון. הרגישות של שיטת המלכודת ויכולתה לזהות פעילות טלומראז ב-lysates תא גולמי הפכה את השיטה הנפוצה ביותר לשימוש הנפוץ ביותר עבור זיהוי פעילות טלומראז. עם זאת, לשיטת ההשמנה יש מגבלות. הטיפול הינו מבוסס ג’ל, ומקשה על ביצוע השכפל הדרוש בינוני ועד תפוקה גבוהה, ולכן מושגת לעתים רחוקות ניתוח סטטיסטי מתאים. יתרה מזאת, היכולת המבוססת על ג’ל קשה לכמת באופן אמין עקב חוסר מזהה פחות מאשר כפולה הבדלים בפעילות טלומראז בין דגימות. התגברות על שתי מגבלות אלה היא קריטית לטיפול בפעילות אנזימטית כגון המלכודת לעבור להגדרות הקליניות או התעשייה לאיתור פעילות טלומראז בדגימות מטופלים או בלימודי עיצוב סמים.
ה-PCR הדיגיטלי פותח בתחילה ב-1999 כאמצעי להמרת האופי האקספוננציאלי והאנלוגי של הPCR לתוך שיטת ליניארי ודיגיטלית מסוג10. ה-PCR הדיגיטלי (ddPCR) הוא החדשנות העדכנית ביותר של מתודולוגיית ה-PCR הדיגיטלית המקורית. ה-PCR הדיגיטלי של Droplet הגיע עם הופעתו של מיקרופלואידיקה מתקדם מיקרופלואידיקה וכימיה אמולסיה שמן במים כדי ליצור באופן אמין טיפות בגודל יציב ובמידה שווה. בניגוד ל-PCR המבוסס על ג’ל ואפילו כמותי, ddPCR יוצר קוונפיקציה מוחלטת של חומר הקלט. המפתח ddPCR הוא הדור של ~ 20,000 תגובות בודדות על ידי מחיצות דגימות לתוך טיפות. בעקבות ה-PCR של נקודת הסיום, הקורא droplet סורק כל droplet בצורה של זרימה-cytometer לספור, לגודל, ולהקליט את הנוכחות או העדר של הזריחה בכל droplet בודדת (כלומר, היעדרות או נוכחות של הגברה PCR ב-droplet). לאחר מכן, באמצעות התפלגות פואסון, מולקולות קלט מוערכות בהתאם ליחס של טיפות חיוביות למספר הכולל של טיפות. מספר זה מייצג הערכה של מספר מולקולות הקלט ב-PCR. יתר על כן, ddPCR מבוצע ומנותח על צלחת 96-באר אשר מאפשר למשתמש להפעיל דגימות רבות, כמו גם לבצע משכפל ביולוגי וטכני לניתוח סטטיסטי תקין. כתוצאה מכך, אנו שילבו את הקוונפיקציה עוצמה והתפוקה הבינונית של הטבע ddPCR עם בדיקת המלכודת כדי לפתח את השיטת Ddpcr11. שיטת העבודה מיועדת למשתמשים ללמוד ולכמת את הפעילות המוחלטת של טלומראז מדגימות ביולוגיות11,12. רגישות ה-ddtrap מאפשרת את כימות הפעילות של טלומראז מדגימות מוגבלות ויקרות, כולל מדידות תא יחיד. יתר על כן, משתמשים יכולים גם ללמוד את ההשפעות של מניפולציות טלומראז ו/או תרופות עם כימות מוחלטת של פחות מאשר שינויים כפולה (~ 50% הבדלים). ה-ddTRAP הוא האבולוציה הטבעית של הגדרת המלכודת לטבע הדיגיטלי והתפוקה הגבוהה יותר של ניסויי מעבדה מודרניים והגדרות קליניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המדידה של פעילות טלומראז היא קריטית לשפע של נושאי מחקר כולל, אבל לא מוגבל, סרטן, טלומראז ביולוגיה, הזדקנות, רפואה רגנרטיבית, ועיצוב מבנה מבוסס סמים. Telomerase RNPs נמוכים בשפע, גם בתאים סרטניים, מה שהופך את האיתור והמחקר של האנזים הזה מאתגר. במאמר זה, תיארנו את ההליכים צעד אחר צעד עבור הצורך החדש שפ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים לאשר את מקורות המימון של מכוני הבריאות הלאומיים (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). תאים קטנים לסרטן הריאות (SHP77 ו H82) היו מתנה נדיבה של ד ר. ג’ון מינין ועדי גזדאר מהמרכז הרפואי UT דרום-מערב.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referenzen
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
