液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応
Summary
我々は正常に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応に採用される標準的なテロメア反復増幅プロトコル (TRAP) アッセイを変換しました。DdTRAP と呼ばれるこの新しいアッセイは、より高感度で定量的であり、様々なヒト細胞内のテロメラーゼ活性のより良い検出および統計分析を可能にします。
Abstract
テロメア反復増幅プロトコル (TRAP) は、所与のサンプル内のテロメラーゼ活性を検出するために最も広く使用されているアッセイです。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法は、ほとんどの細胞溶解物からの酵素活性のロバストな測定を可能にします。蛍光標識されたプライマーを用いたゲルベースのトラップはサンプルのスループットを制限し、サンプルの差を検出する能力は酵素活性の2倍以上の変化に制限される。液滴のデジタルトラップ、ddTRAP は従来のトラップの試金から変更された非常に敏感なアプローチであり、ユーザーが実行ごとの96サンプルの強い分析を行い、DNA の絶対定量化を得ることを可能にする (テロメラーゼの延長プロダクト) は、各 PCR 内で入力します。従って、新しく開発された ddTRAP の試金は従来のゲルベースのトラップの試金の限界を克服し、実験室および臨床設定内のテロメラーゼの活動を測定するためにより有効で、正確な、量的なアプローチを提供する。
Introduction
テロメアは、線状染色体の末端にある動的な DNA-タンパク質複合体です。ヒトテロメアは、出生1で 12-15 キロベース (kb) の長さが異なる 5 ‘-TTAGGGn hexameric の繰り返しの配列で構成されています。ヒトテロメラーゼは、テロメアを維持する ribonucleoprotein 酵素を、HeLa 細胞溶解物 (癌細胞株)2で最初に同定した。共に、テロメアとテロメラーゼは、ゲノム保護、遺伝子調節、および癌細胞不滅性3、4、5、6などの生物学的プロセスのスペクトルにおいて主要な役割を果たしています。
ヒトテロメラーゼは主に、テロメラーゼ逆転写酵素とテロメラーゼ RNA (hTERT および hTERC) の2つの主要成分から構成されています。タンパク質サブユニットは、hTERT、テロメラーゼ酵素の触媒活性逆転写酵素成分である。RNA テンプレート、hTERC は、テロメアを拡張および/または維持するためのテンプレートをテロメラーゼに提供する。ほとんどのヒト体細胞組織は、検出可能なテロメラーゼ活性を有しない。DNA ポリメラーゼが不足している DNA の末端を広げることができないことは、テロメラーゼの欠如とともに、細胞分裂の毎ラウンド後のテロメアの漸進的短縮につながります。これらの現象は、ほとんどの体細胞において、非常に短い長さに達するまでテロメア短縮をもたらし、それによって細胞は複製老化の状態に入る。細胞が分裂できる最大回数はそのテロメア長によって決まり、このブロックはもとづき7への進行を防ぐと考えられています。がん細胞はテロメア誘発複製の老化を克服することができ、テロメラーゼを利用してテロメアを維持することによって増殖を続けています。癌の約 90% がテロメラーゼを活性化し、癌の検出と治療の両方においてテロメラーゼ活性を極めて重要なものにします。
1990年代の TRAP アッセイの開発は、テロメラーゼ酵素の必要な成分の同定、ならびに正常および癌性の両方の細胞および組織の広い範囲におけるテロメラーゼの測定に役立った。元のゲルベース PCR アッセイは、テロメラーゼの活性を検出するために放射能標識された DNA 基質を使用しました。2006では、アッセイは、蛍光標識された基材8、9を用いて非放射性形態に適応した。蛍光標識された基質を使用することにより、ユーザーは正しい励起波長に曝露することによってテロメラーゼ伸長製品をゲル上のバンドとして可視化することができました。トラップアッセイの感度と、粗細胞溶解物中のテロメラーゼ活性を検出する能力は、このアッセイをテロメラーゼ活性検出に最も広く使用されている方法にしました。しかし、TRAP アッセイには限界があります。このアッセイはゲルベースであるため、適度な高スループットの試験では必要とされる反復を行うことが困難であり、適切な統計分析はほとんど達成されません。さらに、ゲルベースのアッセイは、サンプル間のテロメラーゼ活性の2倍未満の差を検出できないため、確実に定量化することが困難である。これら2つの制限を克服することは、患者のサンプルまたは薬物設計研究におけるテロメラーゼの活性を検出するための臨床または業界の設定に移動するトラップなどの酵素活性アッセイにとって重要である。
デジタル PCR は、PCR の指数的およびアナログ的性質を線形およびデジタルアッセイ10に変換する手段として、1999年に最初に開発されました。液滴デジタル PCR (ddPCR) は、元のデジタル PCR の方法論の最新の技術革新です。液滴デジタル PCR は確実に安定した、同じ大きさの液滴を生成するために、高度なマイクロ流体と水中油エマルジョン化学の出現によって来ました。ゲルベースであっても定量 PCR (qPCR) とは異なり、ddPCR は入力材料の絶対定量を生成します。DdPCR の鍵は、サンプルを液滴に分割することによって、〜2万の個々の反応を生成することです。エンドポイント PCR に続いて、液滴読み取り装置は、フローサイトメーターのような方法で各液滴をスキャンし、カウント、サイジング、および個々の液滴における蛍光の有無 (すなわち、各液滴における PCR アンプリコンの存在または不在) を記録する。次いで、ポアソン分布を用いて、液滴の総数に対する正の液滴の比率に基づいて入力分子が推定される。この数値は、各 PCR における入力分子数の推定値を表します。さらに、ddPCR は、ユーザーが多くのサンプルを実行することを可能にし、適切な統計分析のために生物学的および技術的な複製を行うことができる96ウェルプレート上で実行され、分析します。その結果、ddPCR の強力な定量と中程度のスループットの性質をトラップアッセイと組み合わせて、ddTRAP アッセイ11を開発しました。このアッセイは、生物学的試料11,12からの絶対的なテロメラーゼ活性を研究し、確実に定量化するためにユーザが設計されています。DdTRAP の感受性は単一細胞の測定を含む限られた、貴重なサンプルからのテロメラーゼの活動の定量化を可能にする。さらに, ユーザーは、2倍未満の変化 (〜 50% の差) の絶対定量とテロメラーゼの操作および/または薬物の効果を研究することができます。DdTRAP は現代実験室の実験および臨床設定のデジタルおよびより高い効率の性質にトラップの試金の自然な進化である。
Protocol
Representative Results
Discussion
テロメラーゼの活動の測定は、癌、テロメア生物学、老化、再生医療、および構造ベースの薬物設計を含むが、これらに限定されない研究テーマの茄多に重要です。テロメラーゼ RNPs は、がん細胞であっても、豊富に不足しているため、この酵素の検出と研究は困難です。本論文では、新たに開発した ddTRAP アッセイについて、細胞内のテロメラーゼ活性を確実に定量化するためのステップ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、国立衛生研究所 (NIH) (R00 ・ CA197672 ・ 01A1) からの資金調達源を確認したいと考えています。小細胞肺癌線 (SHP77 と H82) は、ジョン・みんなと Adi Gazdar ・メディカル・センターから贈られた、寛大な贈り物でした。
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referenzen
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