Капли цифровая ловушка (ddTRAP): адаптация протокола усиления теломер повторить к капли цифровая полимеразной цепной реакции
Summary
Мы успешно преобразовали стандартный протокол усиления теломер повторения (ловушки) анализ, чтобы быть использованы в капли цифровой полимеразной цепной реакции. Этот новый анализ, называемый ddTRAP, является более чувствительным и количественным, что позволяет более эффективного выявления и статистического анализа деятельности теломеразы в различных человеческих клетках.
Abstract
Протокол усиления теломер повторяется (ловушка) является наиболее широко используемым анализа для обнаружения активности теломеразы в данном образце. Метод полимеразной цепной реакции (ЦР) позволяет для надежных измерений активности фермента от большинств литов клетки. Гель-ловушки на основе с флуоресцентно помечены праймерс границы выборки пропускной способностью, и способность обнаруживать различия в образцах ограничивается два раза или больше изменений в активности фермента. Капли цифровой ловушки, ddTRAP, является весьма чувствительным подходом, который был изменен из традиционного анализа ловушки, что позволяет пользователю выполнять надежный анализ на 96 образцов в перспективе и получить абсолютную количественную оценку ДНК (расширение продуктов теломеразы ) ввода в каждой СР. Таким образом, недавно разработанный анализ ddTRAP преодолевает ограничения традиционного гелевого анализа ловушки и обеспечивает более эффективный, точный и количественный подход к измерению активности теломеразы в лабораторных и клинических условиях.
Introduction
Теломеры являются динамическими комплексами ДНК-протеина на концах линейных хромосом. Человеческие теломеры состоят из массива 5 ‘-TTAGGGn гексафических повторов, которые различаются по длине между 12-15 килотбаз (КБ) при рождении1. Человека теломеразы, рибонуклеопролиоподобный фермент, который поддерживает теломеры, был впервые выявлен в Лобе клеток литов (рак клеточной линии)2. Теломеры и теломеразы играют важную роль в спектре биологических процессов, таких как защита генома, генная регуляция и бессмертие раковых клеток3,4,5,6.
Теломераза человека состоит в основном из двух ключевых компонентов, а именно: теломеразы обратной транскриптазы и РНК теломеразы (hTERT и hTERT, соответственно). Протеиновый Субблок, hTERT, является катализатором активной обратной транскриптазы фермента теломеразы. Шаблон РНК, hTERC, обеспечивает теломеразу с шаблоном для расширения и/или поддержания теломер. Большинство человеческих соматических тканей не имеют обнаруживаемой активности теломеразы. Неспособность ДНК-полимеразы продлить конец отстающих нитей ДНК наряду с отсутствием теломеразы приводит к постепенному укорочению теломер после каждого раунда клеточного деления. Эти явления приводят к укорочению теломер в большинстве соматических клеток до тех пор, пока они не достигнут критической укороченной длины, при которой клетки попадают в состояние репликативного старения. Максимальное количество раз клетка может разделить диктуется его Длина теломер и этот блок для продолжения клеточного деления, как полагают, чтобы предотвратить прогрессирование онкогенеза7. Раковые клетки способны преодолевать индуцированный теломер-репликативное старение и продолжают размножаться, используя теломеразу для поддержания своих теломер. Примерно 90% раковых опухолей активизируют теломеразу, что делает деятельность теломеразы критически важной как в обнаружении, так и в лечении рака.
Разработка анализа ловушки в 1990-х сыграла важную роль в идентификации необходимых компонентов фермента теломеразы, а также для измерения теломеразы в широком диапазоне клеток и тканей, как нормальных, так и раковых. Оригинальный гель для анализа методом ЦР использовал радиоактивно обозначенные ДНК-субстраты для обнаружения активности теломеразы. В 2006 году анализ был адаптирован в нерадиоактивную форму с использованием флуоресцентно маркированных субстратов8,9. С помощью флуоресцентно помечены субстраты, пользователи смогли визуализировать продукты расширения теломеразы как полосы на гель, подвергая его правильной длине волны возбуждения. Чувствительность анализа ловушки и его способность обнаруживать активность теломеразы в сырых литом клеток сделала этот анализ наиболее широко используемым методом для обнаружения активности теломеразы. Однако анализ ловушки имеет свои ограничения. Анализ геля основе, что затрудняет для выполнения необходимых реплицирует в умеренной до высокой пропускной способности исследований, и, таким образом, надлежащего статистического анализа редко достигается. Кроме того, гель на основе анализа трудно количественно достоверно из-за неспособности обнаруживать менее чем два различия в активности теломеразы между образцами. Преодоление этих двух ограничений имеет решающее значение для ферментативной деятельности анализов, таких как ловушка, чтобы перейти к клиническим или промышленных параметров для обнаружения активности теломеразы в образцах пациента или исследования разработки лекарственных препаратов.
Цифровая ЦР была первоначально разработана в 1999 в качестве средства для преобразования экспоненциальной и аналоговой природы ЦР в линейный и цифровой анализ10. Капли цифровой ЦР (ДСР) является самым последним нововведением оригинальной цифровой методологии ЦР. Капли цифровой ЦР произошло с появлением передовых микрофлюидиков и масло-в-воде, химии эмульсии надежно генерировать стабильные и одинаково размера капель. В отличие от геля на основе и даже количественные (КЦР), Дцр генерирует абсолютную количественную оценку материала ввода. Ключом к ddPCR является генерация ~ 20 000 индивидуальных реакций путем разбиения образцов на капли. После окончания точечср, капли читатель сканирует каждую каплю в потоке-cytometer-как мода, подсчет, калибровка, и запись наличия или отсутствия флуоресценции в каждой отдельной капли (например, отсутствие или наличие в каждой капли ЦР-амплитэты). Затем, используя распределение Пуассона, входные молекулы оцениваются на основе соотношения положительных капель к общему количеству капель. Это число представляет собой оценку количества входных молекул в каждой СР. Кроме того, ddPCR выполняется и анализируется на 96-хорошо пластины, которая позволяет пользователю запускать много образцов, а также выполнять биологические и технические реплицирует для надлежащего статистического анализа. В результате мы объединили мощную количественную и умеренно-пропускную природу Дцр с методом анализа ловушки для разработки анализа11ddpcr. Этот анализ предназначен для пользователей, чтобы изучить и надежно количественно абсолютной активности теломеразы из биологических образцов11,12. Чувствительность ddTRAP позволяет количественно определять активность теломеразы из ограниченных и драгоценных образцов, включая измерения одноклеточных измерений. Кроме того, пользователи могут также изучить влияние манипуляций теломеразы и/или лекарств с абсолютной количественной оценкой менее чем двукратности изменений (~ 50% различий). DdTRAP является естественной эволюции ловушки анализа в цифровой и более высокой пропускной характер современных лабораторных экспериментов и клинических условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Измерение активности теломеразы имеет решающее значение для множества исследовательских тем, включая, но не ограничиваясь этим, рак, биологию теломер, старение, регенеративную медицину и структуру, основанную на разработке лекарственных препаратов. Теломеразы РНВ являются низким изо…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить источники финансирования, выделенные национальными институтами здравоохранения (НИЗ) (НИР-R00-CA197672-01A1). Мелкоклеточный рак легких линий (SHP77 и H82) был щедрый подарок от доктора Джона Минна и Ади Газдар от Юта Юго-Западного медицинского центра.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referenzen
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
