المصيدة الرقمية الحبريه (ddTRAP): تكييف بروتوكول تضخيم التيتيمير المكرر إلى التفاعل المتسلسل الرقمي لسلسله البلمره
Summary
قمنا بنجاح بتحويل معيار التضخيم المكرر لبروتوكول التيتيمير (فخ) ليتم استخدامه في التفاعلات المتسلسلة الرقمية للبوليميريز. هذا الفحص الجديد ، ويسمي ddTRAP ، هو أكثر حساسية وكميه ، مما يسمح للكشف بشكل أفضل والتحليل الإحصائي للنشاط التيلوميراز داخل الخلايا البشرية المختلفة.
Abstract
ان بروتوكول تضخيم التيلوميريه (فخ) هو الاختبار الأكثر استخداما للكشف عن نشاط التيتيلوراز داخل عينه معينه. يسمح الأسلوب القائم علي تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) باجراء قياسات قويه لنشاط الانزيم من معظم الخلايا الخلوية. فخ القائم علي هلام مع فلوريسسينتلي المسمي الإشعال حدود الانتاجيه عينه ، والقدرة علي الكشف عن الاختلافات في عينات يقتصر علي اثنين اضعاف أو أكبر التغييرات في نشاط الانزيم. فخ الرقمية الحبريه, ddTRAP, هو نهج حساسة للغاية التي تم تعديلها من المقايسة فخ التقليدية, تمكين المستخدم من اجراء تحليل قوي علي 96 عينات لكل تشغيل والحصول علي التحديد الكمي المطلق للحمض النووي (التيلوميراز تمديد المنتجات ) المدخلات داخل كل PCR. ولذلك ، فان فحص ddTRAP المطور حديثا يتغلب علي القيود التي تفرضها المقايسة التقليدية القائمة علي الهلام ويوفر نهجا أكثر كفاءه ودقه وكميه لقياس نشاط التيلوميراز داخل المختبرات والإعدادات السريرية.
Introduction
التيلوميرات هي مركبات حيوية من بروتين الحمض النووي في نهايات الكروموسومات الخطية. وتتكون التيلوميرات البشرية من مجموعه من 5 ‘-TTAGGGn هيكامريميك تكرار التي تختلف في الطول بين 12-15 كيلوبياسيس (kb) عند الولادة1. الإنسان التيلوميراز ، انزيم ريبونكليوبروتين الذي يحافظ علي التيلوميرات ، تم تحديده لأول مره في خليه هيلا (خط الخلايا السرطانية)2. معا ، تلعب التيلوميرات والتيلوميراز دورا رئيسيا في طيف من العمليات البيولوجية مثل حماية الجينوم ، وتنظيم الجينات ، وخلود الخلايا السرطانية3،4،5،6.
يتكون التيلوميراز البشري في المقام الأول من مكونين رئيسيين ، هما الناسخ العكسي التيلوميراز والحمض الريبي التيلوميراز (hTERT و Htert ، علي التوالي). الوحدة الفرعية للبروتين ، hTERT ، هي مكون الناسخ العكسي النشط المحفز لانزيم التيلوميراز. يوفر قالب RNA ، hTERC ، التيلوميراز مع القالب لتمديد و/أو الحفاظ علي التيلوميرات. معظم الانسجه الجسدية البشرية ليس لها نشاط قابل للكشف عن التيلوميراز. ان عدم قدره البوليميرات الحمض النووي علي تمديد نهاية الحبل المتخلف من الحمض النووي إلى جانب عدم وجود التيلوميراز يؤدي إلى التقصير التدريجي للوميرات بعد كل جولة من الانقسام الخلوي. وتؤدي هذه الظواهر إلى تقصير التيلوميريه في معظم الخلايا الجسدية حتى تصل إلى الطول المختصر للغاية ، حيث تدخل الخلايا حاله من الشيخوخة التكرارية. والعدد الأقصى من المرات خليه يمكن تقسيم تمليه طول التيتيمير وهذا كتله لاستمرار انقسام الخلايا ويعتقد لمنع التقدم إلى اونكوجينيسيس7. الخلايا السرطانية قادره علي التغلب علي الشيخوخة المستحثة التيلوميريه والاستمرار في التكاثر عن طريق استخدام التيتيلوراز للحفاظ علي التيلوميرات. وينشط حوالي 90% من السرطانات التيلوميراز ، مما يجعل نشاط التيلوميراز مهما للغاية في كل من الكشف عن السرطان وعلاجه.
وكان تطوير اختبار الفخ في التسعينات مفيدا في تحديد المكونات الضرورية لانزيم التيلوميراز ، فضلا عن قياس التيلوميراز في مجموعه واسعه من الخلايا والانسجه ، سواء كانت طبيعيه أو سرطانيه. الأصلي المستندة إلى هلام الفحص PCR تستخدم راديوب# نشاط المسمي ركائز الحمض النووي للكشف عن النشاط التيلوميراز. في 2006, تم تكييف الفحص في شكل غير مشع باستخدام فلوريسسينتلي المسمي ركائز8,9. باستخدام ركائز فلوريسسينتلي المسمية ، كان المستخدمون قادرين علي تصور منتجات تمديد التيلوميراز كعصابات علي هلام من خلال تعريضه لطول الموجه الاثاره الصحيحة. وقد جعلت حساسية الفحص فخ وقدرته علي الكشف عن النشاط التيلوميراز في الخلايا الخام لهذا الفحص الطريقة الأكثر استخداما للكشف عن النشاط التيلوميراز. ومع ذلك ، الفحص فخ له قيود. ويستند الفحص إلى الهلام ، مما يجعل من الصعب اجراء النسخ المتماثلة الضرورية في الدراسات المتوسطة إلى العالية الانتاجيه ، التالي ، نادرا ما يتحقق التحليل الإحصائي السليم. وعلاوة علي ذلك ، من الصعب تحديد الفحص القائم علي الهلام بشكل موثوق بسبب عدم قدره الكشف عن الاختلافات المزدوجة في نشاط التيلوميراز بين العينات. التغلب علي هذين القيدين أمر بالغ الاهميه لاختبارات النشاط الانزيمي مثل فخ للانتقال إلى الإعدادات السريرية أو الصناعية للكشف عن نشاط التيلوميراز في عينات المريض أو دراسات تصميم المخدرات.
تم تطوير PCR الرقمية في البداية في 1999 كوسيلة لتحويل الطبيعة الاسيه والتناظرية من PCR إلى الفحص الخطي والرقمي10. الحبريه الرقمية PCR (ddPCR) هو أحدث الابتكارات من منهجيه PCR الرقمية الاصليه. وجاءت القطرة الرقمية PCR مع ظهور ميكروفلويديكس المتقدمة والنفط في المياه مستحلب الكيمياء لتوليد موثوق بها قطرات مستقره والحجم علي قدم المساواة. علي عكس الهلام القائم وحتى PCR الكمي (qPCR) ، ddPCR يولد التحديد الكمي المطلق للمواد المدخلة. المفتاح إلى ddPCR هو توليد التفاعلات الفردية ~ 20,000 عن طريق تقسيم عينات إلى قطرات. بعد نقطه النهاية PCR ، يمسح القارئ القطيرات كل قطره في الأزياء التي تشبه التدفق المضخم للخلايا ، والعد ، والتحجيم ، وتسجيل وجود أو غياب الفلورية في كل قطره فرديه (اي غياب أو وجود الرموز المصغرة PCR في كل قطره). ثم ، باستخدام توزيع بواسون ، يتم تقدير جزيئات الإدخال استنادا إلى نسبه القطرات الموجبة إلى العدد الإجمالي للقطيرات. يمثل هذا الرقم تقديرا لعدد جزيئات الإدخال في كل PCR. وعلاوة علي ذلك ، يتم تنفيذ ddPCR وتحليلها علي لوحه 96 البئر الذي يسمح للمستخدم لتشغيل العديد من العينات ، فضلا عن أداء البيولوجية والتقنية والنسخ المتماثلة للتحليل الإحصائي السليم. ونتيجة لذلك ، فقد جمعنا بين القياس الكمي القوي والطبيعة المتوسطة الانتاجيه لddpcr مع مقايسة الفخ لتطوير الفحص الخاص ب Ddpcr11. تم تصميم هذا الفحص للمستخدمين لدراسة وتحديد كميه النشاط التيلوميراز المطلق من العينات البيولوجية11،12. وتسمح حساسية ddTRAP بالتحديد الكمي لنشاط التيلوميراز من العينات المحدودة والثمينة ، بما في ذلك قياسات الخلايا الواحدة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن للمستخدمين أيضا دراسة اثار التلاعب التيلوميراز و/أو المخدرات مع التحديد الكمي المطلق لأقل من التغييرات مزدوجة (~ 50 ٪ الاختلافات). و ddTRAP هو التطور الطبيعي لفحص فخ في الطبيعة الرقمية والانتاجيه العالية من التجارب المختبرية الحديثة والإعدادات السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد قياس نشاط التيلوميراز أمرا حاسما بالنسبة لعدد كبير من المواضيع البحثية بما في ذلك ، علي الرغم من عدم الاقتصار علي ، السرطان ، والبيولوجيا التيلوميريه ، والشيخوخة ، والطب التجديدي ، وتصميم الادويه المستندة إلى البنية. التيلوميراز RNPs منخفضه الوفرة ، حتى في الخلايا السرطانية ، مما يجعل ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بمصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R00-CA197672-01A1). كانت الخلايا الصغيرة لسرطان الرئة (SHP77 و H82) هديه سخية من المركز الطبي لجنوب غرب البلاد ، جون مينا وعدي غازدار.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referenzen
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
