皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング
Summary
形態学的変化は、活性化後の免疫応答性線維芽細胞で起こり、細胞募集の変化を促進する。遺伝子組み換え線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)-creと組み合わせて2光子イメージングを利用する。tdTomatoフロキセドストップフロキシング(TB/TB)マウスラインと緑色蛍光タグ付きリポ多糖-FITCは、真皮線維芽細胞におけるリポ多糖類の非常に特異的な取り込みおよび生体内の形態変化を示すことができる。
Abstract
線維芽細胞は、活性化時に形態を変化させる間葉細胞であり、最終的にそれらが位置する組織の微小環境に影響を与える。従来のイメージング技術は、固定組織におけるタンパク質相互作用や形態の同定に役立ちますが、細胞がタンパク質を結合して取り込む速度に関する洞察を与えることができ、一度その形態がどのように変化するかを活性化することはできません。生 体内。本研究では、2つの大きな疑問を提起する:1)トール様受容体-4(TLR4)とリポ多糖(LPS)相互作用による線維芽細胞活性化の時間経過とは2)これらの細胞は一度活性化されるとどのように振る舞うのか?2光子イメージングを用いて、遺伝子レポーターマウスラインの末梢線維芽細胞に発現した覚後受容体TLR4に結合するLPS-FITCの能力を評価する新しい技術を開発した。FSP1cre;生体内のtdTomatoロックストップロックス。このユニークなアプローチにより、研究者は、タンパク質が細胞の挙動をどのように変化させるかを理解する上で、生細胞と相互作用するタンパク質の詳細なタイムラプスビデオや写真を作成することができます。
Introduction
リポ多糖類(LPS)は、グラム陰性菌1の外膜に見出されるエンドトキシンである。LPSは、トール様受容体4(TLR4)/CD14/MD2受容体複合体2に対して高い結合親和性を有する。TLR4は、広範囲の免疫細胞、間葉系細胞、および感覚ニューロン3、4、5のサブセットの外膜上に一般的に見出されるパターン認識受容体である。免疫細胞に発現するTLR4の活性化は、MyD88依存性および独立した第2メッセンジャーシステムにつながり、核因子カッパベータ(NFκB)細胞の核への転移で終わる。これは、プロトティクス性免疫細胞がインターロイキン(IL)-1β、IL-6、およびTNF-α6などのプロトチピックサイトカインを産生し、放出する原因となる。しかし、他の細胞型がTLR4刺激にどのように反応するかは、それほど明確ではない。線維芽細胞は、癌および嚢胞性線維症などの病態の広い範囲に関与しており、最近、単球化学引き出しおよび炎症を促進する役割を果たすることが示されている7,8,9. 初期のエビデンスは、線維芽細胞(マトリックスメタロプロテイナゼス(MmP)、メタロプロテイラー酵素(TIMP)、および線維芽細胞の組織阻害剤によって放出される因子を示唆しているように、急性および慢性疼痛の発症における線維芽細胞の役割に興味を持っています。成長因子(FGF)は神経因性疼痛10に関与している。
細胞の活性化状態は、即時早期遺伝子の誘導、タンパク質発現の変化、細胞増殖、および形態変化11、12、13を含む様々な因子によって決定することができる。細胞の活性化が病理にどのように寄与するかについての疑問に答えるために存在する多くのテクニックがありますが、それらはすべて限界があります。原型的な免疫組織化学は、蛍光タグ付き抗体を使用して固定組織に目的とするタンパク質を標識するが、これは特異的でなく、多くの場合、実りある結果を得る前に重要なトラブルシューティングを必要とする14。ウェスタンブロッティングは、死後組織におけるタンパク質発現のレベルを比較する際に有用な技術である。しかし、組織学的成分はこの技術に欠けており、研究者は形態15の変化を特定することができない。RNA-Seqを使用すると、多くの場合、洞察に満ちたデータを得るサンプル中のメッセンジャーRNAの存在を定量化できます。しかし、転写と翻訳の間のギャップは、刺激16の後に時間的解決を持つことを困難にする。共焦点イメージングは、組織17の断面に存在するタンパク質の発現および共局在を決定するのに有用である。多くの場合、これは組織試料全体を代表するものではありません。対照的に、マルチフォトン顕微鏡は、ユーザーがサンプルに約1mmの深さに画像を撮ることを可能にし、包括的な3次元表現18を作成する。したがって、これらの実験から収集されたデータは、生体組織の高度にプラスチックと相互接続された微小環境とより直接的に関連しているので、我々は生体内、2光子イメージングの準備に焦点を当てることを選択します。
生体内でタンパク質受容体相互作用を研究する利点は、死後組織抽出19の有害で予測不可能な影響なしに、細胞が刺激にリアルタイムで反応する方法を明確に捕捉できることである。さらに、縦方向の研究は、活性化のために起こりう可能性のある細胞の可塑性およびプライミングを評価するために行われてもよい。 2光子イメージングを用いて、外部刺激を加えた場合の微小環境の完全性を維持します。このプロトコルは、生体内で数時間にわたって蛍光タグ付きLPSの末梢注入後の線維芽細胞中の分子の取り込みおよび線維芽細胞活性化におけるTLR4の役割を同定する方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
間違いなく生体内2光子イメージングの最も重要なステップは:1)マルチフォトンのセットアップと実験的なニーズ21、22のための右の遺伝的レポーターマウスと蛍光タグ付きタンパク質を選択します。2)組織23内の細胞集団の正確な表現を持つために正しい焦点面をイメージング;3)不適切に固定された動物24による動…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、許可 NS096030 (MDB) によってサポートされます。また、イメージングコアマネージャーVed Prakashに感謝したいと思います。また、UTダラスのオリンパス・ディスカバリー・センター/イメージング・コア施設の設備とサポートに感謝します。
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
Referenzen
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