In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele
Summary
As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in vivo.
Abstract
Os fibroblastos são células mesenquimais que alteram sua morfologia após a ativação, influenciando, em última análise, o microambiente do tecido em que estão localizados. Embora as técnicas tradicionais da imagem latente sejam úteis em identificar interações e morfologia da proteína no tecido fixo, não podem dar a introspecção a respeito de como rapidamente as pilhas podem ligar e proteínas da tomada, e uma vez que ativadas como sua morfologia muda no vivo. No presente estudo, pedimos 2 perguntas principais: 1) qual é o tempo-curso da ativação do fibroblasto através da interação Toll-like do receptor-4 (TLR4) e do lipopolissacarídeo (LPs) e 2) como essas células se comportam uma vez ativadas? Usando a imagem latente do 2-Photon, nós desenvolvemos uma técnica nova para avaliar a habilidade de LPs-FITC de ligar a seu receptor cognato, TLR4, expressado em fibroblastos periféricos na linha genética do rato do repórter; FSP1cre; TdtomateLOX-Stop-LOX in vivo. Esta abordagem única permite que os pesquisadores criem em profundidade, vídeos de lapso de tempo e/ou imagens de proteínas que interagem com células ao vivo que permite ter um nível aumentado de granularidade na compreensão de como as proteínas podem alterar o comportamento celular.
Introduction
Lipopolissacarídeo (LPS) é uma endotoxina encontrada na membrana externa de bactérias Gram-negativas1. LPS tem uma afinidade de ligação elevada para o complexo do receptor do Toll-like 4 (TLR4)/CD14/MD2. TLR4 é um receptor de reconhecimento de padrão comumente encontrado na membrana externa de uma ampla gama de células imunes, células mesenquimais, e um subconjunto de neurônios sensoriais3,4,5. A ativação de TLR4 expressa em pilhas imunes conduz aos sistemas do mensageiro do segundo do MyD88-dependente e o independente, terminando com o translocação do beta do Kappa do nuclear-fator (NFκB) ao núcleo da pilha. Isso faz com que a célula imune protootípica produza e libere citocinas pró-inflamatórias, como interleucina (IL)-1 β, IL-6 e TNF-α6. No entanto, como outros tipos de células respondem à estimulação TLR4 não é tão claro. Os fibroblastos têm sido implicados em uma ampla gama de patologias, como cânceres e fibrose cística, e têm sido mostrados recentemente para desempenhar um papel de quimio-atração de monócitos e promovendo a inflamação7,8,9. Nosso laboratório está interessado no papel dos fibroblastos no desenvolvimento da dor aguda e crônica, como evidências precoces sugerem que os fatores liberados pelos fibroblastos (metaloproteinases de matriz (MMPs), inibidor tecidual de metaloproteinases (TIMPs) e fibroblastos fatores de crescimento (FGFs)) estão envolvidos na dor neuropática10.
Os Estados de ativação das células podem ser determinados por uma variedade de fatores que incluem: indução de genes imediatos precoces, expressão protéica alterada, proliferação celular e alterações morfológicas11,12,13. Existem muitas técnicas que existem para responder a perguntas que podemos ter sobre como a ativação das células contribui para patologias, mas todos eles têm suas limitações. A imunohistoquímica prototípica usa anticorpos marcados cDNAs para rotular proteínas de interesse em tecido fixo, o que pode ser inespecífico e muitas vezes requer solução de problemas significativa antes de produzir resultados frutíferos14. A mancha ocidental é uma técnica útil ao comparar níveis de expressão da proteína no tecido post-mortem; Entretanto, o componente histológico está faltando nessa técnica e os pesquisadores não conseguem identificar alterações na morfologia15. O RNA-Seq nos permite quantificar a presença de RNA mensageiro em uma amostra que, em muitos casos, produz dados perspicazes; Entretanto, a lacuna entre transcrição e tradução dificulta a resolução temporal após um estímulo16. A imagem latente confocal é útil em determinar a expressão e a colocalização das proteínas que existem em uma seção transversal dos tecidos17. Muitas vezes, isso não é representativo da totalidade da amostra de tecido. Em contraste, microscópios multifótons permitem aos usuários imagem de aproximadamente 1 mm de profundidade em uma amostra, criando uma representação tridimensional abrangente18. Conseqüentemente, nós escolhemos centrar-se sobre in vivo, 2 Preps da imagem latente do fotão, porque os dados recolhidos destes experimentos são mais diretamente relacionable ao microambiente altamente plástico e interligado do tecido vivo.
Uma vantagem de estudar interações proteína-receptor in vivo é que podemos capturar claramente como as células respondem a um estímulo, em tempo real, em seu ambiente nativo sem a influência prejudicial e imprevisível da extração do tecido pós-morte19. Além disso, estudos longitudinais podem ser realizados para avaliar a plasticidade celular e a escorva que pode ocorrer por causa da ativação. Usando a imagem latente do 2-Photon, nós preservamos a integridade do microambiente atual quando um estímulo externo é aplicado. Este protocolo fornece uma maneira de identificar a captação das moléculas nos fibroblasto que seguem a injeção periférica de LPs cDNAs etiquetados sobre o curso de diversas horas in vivo e o papel de TLR4 na ativação do fibroblasto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indiscutivelmente os passos mais importantes da in vivo 2-Photon Imaging são: 1) escolhendo o rato genético direito do repórter e a proteína fluorescently-etiquetada para a instalação e as necessidades experimentais do multi-Photon21,22; 2) imagem do plano focal correto para ter uma representação exata da população de células no tecido23; 3) minimizando o movimento devido a um animal imobilizado indevidamente24…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é suportado pela concessão NS096030 (MDB). Nós também gostaríamos de agradecer ao gerente de imagem central ved Prakash. Nós também gostaríamos de agradecer Olympus Discovery Center/Imaging Core facilidade em UT Dallas para fornecer equipamentos e suporte
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
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