In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin
Summary
Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios morfológicos in vivo.
Abstract
Los fibroblastos son células mesenquimales que cambian su morfología al activarse, influyendo en última instancia en el microambiente del tejido en el que se encuentran. Aunque las técnicas tradicionales de diagnóstico por imágenes son útiles para identificar las interacciones proteicas y la morfología en el tejido fijo, no son capaces de dar una idea de la rapidez con la que las células son capaces de unir y tomar proteínas, y una vez que se activó cómo cambia su morfología en vivo. En el presente estudio, hacemos 2 preguntas principales: 1) ¿cuál es el curso de tiempo de activación de fibroblastos a través de la interacción de receptor-4 (TLR4) y lipopolisacárido (LPS) y 2) ¿cómo se comportan estas células una vez activadas? Utilizando imágenes de 2 fotones, hemos desarrollado una técnica novedosa para evaluar la capacidad de LPS-FITC para unirse a su receptor cognado, TLR4, expresado en fibroblastos periféricos en la línea de ratón reportero genético; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Este enfoque único permite a los investigadores crear videos en profundidad y lapso de tiempo y/o imágenes de proteínas que interactúan con células vivas que permiten tener un mayor nivel de granularidad para entender cómo las proteínas pueden alterar el comportamiento celular.
Introduction
El lipopolisacárido (LPS) es una endotoxina que se encuentra en la membrana externa de las bacterias gramnegativas1. LPS tiene una alta afinidad de unión para el receptor de peaje 4 (TLR4)/CD14/MD2 complejo receptor2. TLR4 es un receptor de reconocimiento de patrones comúnmente encontrado en la membrana externa de una amplia gama de células inmunitarias, células mesenquimales, y un subconjunto de neuronas sensoriales3,4,5. La activación de TLR4 expresada en las células inmunitarias conduce a sistemas de segundo mensajero independientes y dependientes de MyD88, terminando con la translocación de kappa beta (NF-B) de factor nuclear al núcleo de la célula. Esto hace que la célula inmune prototípica produzca y libere citoquinas proinflamatorias como Interleucina (IL)-1o, IL-6, y TNF-6 . Sin embargo, la forma en que otros tipos de células responden a la estimulación TLR4 no es tan clara. Los fibroblastos se han implicado en una amplia gama de patologías como cánceres y fibrosis quística y recientemente se ha demostrado que desempeñan un papel monocitos quimioatracción y promover la inflamación7,8,9. Nuestro laboratorio está interesado en el papel de los fibroblastos en el desarrollo del dolor agudo y crónico, como la evidencia temprana sugiere que los factores liberados por los fibroblastos (metaloproteinasas de matriz (MMP), inhibidor del tejido de las metaloproteinasas (TimOP), y fibroblastos factores de crecimiento (FMG)) están involucrados en el dolor neuropático10.
Los estados de activación de las células pueden determinarse por una variedad de factores que incluyen: inducción de genes inmediatos-tempranos, expresión de proteínas alterada, proliferación celular y cambios morfológicos11,12,13. Hay muchas técnicas que existen para responder preguntas que podemos tener sobre cómo la activación de las células contribuye a las patologías, pero todas tienen sus limitaciones. La inmunohistoquímica prototípica utiliza anticuerpos etiquetados fluorescentemente para etiquetar proteínas de interés en el tejido fijo, que pueden ser inespecíficos y a menudo requieren una solución de problemas significativa antes de producir resultados fructíferos14. La hinchazón occidental es una técnica útil cuando se comparan los niveles de expresión de proteínas en el tejido post mortem; sin embargo, el componente histológico carece de esta técnica y los investigadores son incapaces de identificar cualquier cambio en la morfología15. RNA-Seq nos permite cuantificar la presencia de ARN mensajero en una muestra que en muchos casos produce datos perspicaces; sin embargo, la brecha entre la transcripción y la traducción hace que sea difícil tener resolución temporal después de un estímulo16. La imagen confocal es útil para determinar la expresión y la colocalización de las proteínas que existen en una sección transversal de los tejidos17. A menudo, esto no es representativo de la totalidad de la muestra de tejido. Por el contrario, los microscopios multifotón permiten a los usuarios crear imágenes de aproximadamente 1 mm de profundidad en una muestra, creando una representación tridimensional completa18. Por lo tanto, elegimos centrarnos en las preparaciones de imágenes in vivo, 2 fotónes, ya que los datos recopilados de estos experimentos son más directamente relacionados con el microambiente altamente plástico e interconectado del tejido vivo.
Una ventaja de estudiar las interacciones proteína-receptor in vivo es que podemos capturar claramente cómo las células responden a un estímulo, en tiempo real, en su entorno nativo sin la influencia dañina e impredecible de la extracción de tejido post mortem19. Además, se pueden realizar estudios longitudinales para evaluar la plasticidad celular y el cebado que puede ocurrir debido a la activación. Mediante el uso de imágenes de 2 fotones, preservamos la integridad del microambiente presente cuando se aplica un estímulo externo. Este protocolo proporciona una manera de identificar la absorción de moléculas en fibroblastos después de la inyección periférica de LPS etiquetado fluorescentemente en el transcurso de varias horas in vivo y el papel de TLR4 en la activación de fibroblastos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Podría decirse que los pasos más importantes de la imagen in vivo de 2 fotones son: 1) Elegir el ratón reportero genético adecuado y proteína etiquetada fluorescentemente para la configuración de varios fotones y las necesidades experimentales21,22; 2) tomar imágenes del plano focal correcto para tener una representación precisa de la población de células en el tejido23; 3) minimizar el movimiento debido a un animal inmovilizado …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la subvención NS096030 (MDB). También nos gustaría dar las gracias al gerente central de imágenes Ved Prakash. También nos gustaría agradecer a las instalaciones de Olympus Discovery Center/Imaging Core en UT Dallas por proporcionar equipo y apoyo
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
Referenzen
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
