Robuust, ligatuur-geïnduceerde model van lymfklier-periodontitis voor de evaluatie van orale neutrofielen
Summary
Dit artikel presenteert een protocol voor de vaststelling van een ligatuur-geïnduceerde model van de parodontitis Murine met meerdere maxillaire Molars, resulterend in grotere gebieden van de betrokken gingivale weefsel en bot voor latere analyse, alsmede verminderde dierlijke gebruik. Een techniek om orale neutrofielen te beoordelen op een manier die analoog is aan menselijke proefpersonen wordt ook beschreven.
Abstract
De belangrijkste voordelen van het bestuderen van de pathofysiologie van parodontale ziekte met behulp van Murine-modellen zijn de verlaagde kosten van dieren, array van genetisch gemodificeerde stammen, het enorme aantal analyses dat kan worden uitgevoerd op geoogste zachte en harde weefsels. Veel van deze systemen zijn echter onderhevig aan procedurele kritieken. Als alternatief, het ligatuur-geïnduceerde model van parodontale ziekte, gedreven door de gelokaliseerde ontwikkeling en het behoud van een dysbiotische orale microbiome, kan worden gebruikt, die snel wordt geïnduceerd en relatief betrouwbaar. Helaas zijn de varianten van het ligatuur-geïnduceerde Murine parodontitis protocol geïsoleerd tot de focale gebieden van het parodontium en onderhevig aan voortijdige avulsie van de geïnstalleerde ligatuur. Dit minimaliseert de hoeveelheid weefsel die beschikbaar is voor latere analyses en verhoogt het aantal dieren dat nodig is voor onderzoek. Dit protocol beschrijft de precieze manipulaties die nodig zijn om verlengde molaire ligaturen te plaatsen met een verbeterde retentie en het gebruik van een nieuwe Spoeltechniek om orale neutrofielen bij muizen te herstellen met een alternatieve aanpak die de bovengenoemde technische uitdagingen.
Introduction
Periodontale ziekte (PD) is een osteolytische aandoening die gepaard gaat met een significante gastheer morbiditeit en economische last, die zich manifesteert door gingivale ontsteking en verlies van zowel zachte weefsel gehechtheid als osseeuze steun voor de aangetaste tandheelkunde1,2,3,4. Dit proces wordt beheerst door interacties tussen de mondelinge microbiota en aangeboren immuunsysteem van de gastheer. Het wordt ook geassocieerd met exacerbatie van andere systemische ontstekingsziekten, waaronder diabetes, hart-en vaatziekten, en kanker5,6,7,8. Historisch gezien was het veronderstelde dat PD-pathogenese afhankelijk is van grote hoeveelheden specifieke bacteriën zoals Porphyromonas gingivalis9. Recent bewijs suggereert echter dat de microbiële component van PD wordt gemedieerd door de tandheelkundige biofilm. De biofilm is een georganiseerde, complexe Gemeenschap van talrijke micro-organismen die kunnen bestaan in gezonde symbiotische en destructieve dysbiotic Staten10,11. De mondelinge biofilm geeft normaliter weerstand aan de gastheer door te voorkomen dat de oprichting van Foci van pathogene bacteriën en bevordert ideale gingivale weefselstructuur en functie door regulering van de gastheer immuunrespons12,13. Verstoringen van de evenwichts verhouding tussen commensale organismen in de mondholte en het gastheer immuunsysteem kunnen leiden tot veranderingen in weefselhomeostase, resulterend in dysbacteriose en ontwikkeling van de Hallmark klinische en radiografische verschijningen van PD5,10,12,13,14.
Interessant is dat de oprichting van een mondelinge dysbacteriose, terwijl vereist voor de initiatie van PD, niet voldoende is om PD in alle individuen te stimuleren, en te elueren naar het vermogen van de gastheer immuunrespons om de overgang van microbiota tussen symbiotische en dysbiotische toestanden15te ondermijnen. Dit plaatst een bijzondere schijnwerper op de middelen waardoor PD een van de leidende karakters van het aangeboren immuunsysteem beïnvloedt, namelijk de polymorfonucleaire granulocyt (PMN), of neutrofielen, van lokale en systemische perspectieven16,17.
Bij mensen worden PMNs geworven uit de circulatie met een snelheid van ~ 2 x 106 cellen/h in gezonde periodontale bindweefsels, waar ze de overheersende leukocyten populatie zijn. Hier worden ze vervolgens uit de gingivale Sulcus in de mondholte gezet als een onderdeel van de gingivale creviculaire vloeistof. In aanwezigheid van PD, neutrofilie manifesten in de bloedsomloop en de mondholte, waar deze Effector cellen bezitten een hyperinflammatoire fenotype dat leidt tot de bovengenoemde vernietiging van de parodontium17,18,19,20,21,22. Daarom is het van het allergrootste belang om de rol van PMNs in PD en andere systemische ontstekings condities te begrijpen.
Hoewel algemeen wordt aanvaard dat chronische ziekten samengebonden zijn met PD, moeten de onderliggende mechanismen nog worden opgehelderd, wat bijdraagt aan moeilijkheden bij het beheer van deze morbide en potentieel fatale systemische omstandigheden. Meerdere experimentele diermodellen, elk met unieke voor-en nadelen, zijn gebruikt om de pathofysiologie van PD23,24bestuderen. Specifiek gericht op Murine-modellen, zijn er verschillende protocollen waarmee de studie van PD wordt vergemakkelijkt; ze bezitten echter verschillende technische en fysiologische tekortkomingen25,26,27,28,29,30,31.
Ten eerste vereist het Oral maagsonde Mouse model talrijke orale inoculaties van humane parodontale pathogenen om gingivale ontsteking en botverlies te genereren. Bovendien wordt het meestal voorafgegaan door een periode van antibioticabehandeling om de Murine commensale Oral flora25te ondermijnen. Dit model vereist vaak gespecialiseerde training om de orale gavage veilig uit te voeren, gebruikt slechts een kleine fractie van parodontale pathogenen uit de complexere menselijke orale microbiome, en vereist enkele maanden om alveolaire botverlies vast te stellen.
In tegenstelling, chemisch geïnduceerde Murine modellen maken gebruik van de mondelinge levering van trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS) of dextran sulfaat natrium (DSS), agenten vaak gebruikt bij het vaststellen van Murine modellen van colitis over een periode van enkele maanden voor het opwekken van periodontale botverlies26. Intraorale en extraoraal Abscess gebaseerde modellen zijn beschikbaar, waarbij de Murine snijtanden en weefsels van de dorsum evenals calvarium, respectievelijk. In het voormalige abces-model worden verschillende injecties van bacteriën toegediend, waardoor meerdere gingivale abcessen en een tekort aan alveolaire botverlies worden gebruikt, wat het gebruik ervan in de studie van PD beperkt. De laatste abces modellen zijn aanzienlijk meer geschikt voor het bestuderen van bacteriële virulentie, ontsteking, en botresorptie op plaatsen buiten de mondholte, die de evaluatie van het parodontium en orale microbiome27,28,29,30,31elimineert.
Met behulp van het ligatuur-geïnduceerde model van parodontitis, is een gevlochten zijde hechtmiddel vaak rond de tweede molaire geïnstalleerd. Als alternatief kan een enkel lineair segment van hechtmateriaal worden ingevoegd tussen de eerste en de tweede kiezen32,33. Het doel van de ligatuur plaatsing is het vergemakkelijken van bacteriële accumulatie en het genereren van dysbiosis binnen de gingivale sulci, resulterend in parodontale weefsel ontsteking en vernietiging van de weefsels componeren van het parodontium. Met name, dit model is geschikt voor het produceren significant meer alveolaire botverlies in vergelijking met de meer algemeen gebruikte mondelinge maagsonde model34. Verdere complicerende het gebruik van de orale maagsonde model is de natuurlijke weerstand van verschillende stammen van muizen (dat wil zeggen, C57BL/6) aan het ontwikkelen van alveolaire botverlies. Dit is ook problematisch, aangezien deze stam het vaakst wordt gebruikt in op muriene gebaseerd dierlijk onderzoek35.
Bestaande procedures beschreven door marchesan et al. en Abe en hajishengallis werden bedacht om de technische handeling van het plaatsen van de ligatuur33,36te vereenvoudigen. Helaas vereist het vroegere protocol gespecialiseerde 3D-geprinte apparatuur en heeft het potentieel voor vroegtijdig ligatuur verlies, waardoor het dieren gebruik toeneemt en de kosten die gepaard gaan met extra tijd doorgebracht in de operatiekamer. Bovendien, beide protocollen genereren alleen kleine gebieden van de zieke parodontium beschikbaar voor een studie.
De voordelen van deze techniek zijn gebaseerd op de gelijktijdige studie van orale dysbiose en immunologie die het periodontium beheersen, het gebruik van laaggeprijsde dieren met verschillende genetische achtergronden, en eenvoudige huisvestings-en veehouderijpraktijken. Als zodanig moeten doelstellingen zijn om de hoeveelheid ziek weefsel te maximaliseren en, in pogingen om de beginselen van vermindering van dierlijk onderzoek te oefenen, de dier consumptie tot een zo laag mogelijk niveau te reduceren. Dit vereist dat alle dieren in experimentele analyses37kunnen worden opgenomen. Er moet echter worden opgemerkt dat ongeacht welk diermodel van parodontale ziekte wordt gebruikt, er geen enkel model is dat elk element van de menselijke PD-pathofysiologie omvat.
Dit nieuwe protocol maakt gebruik van de plaatsing van een ligatuur rond meerdere maxillaire molaire tanden met behulp van instrumentatie en materialen die zijn gevonden in de meeste laboratoria. Het maakt voldoende tijd om gemakkelijk en met vertrouwen een ligatuur te installeren die waarschijnlijk niet voortijdig wordt avulse. Tot slot, zoals pmns de vernietiging van het parodontium in PD coördineert, wordt ook een nieuwe methodologie gepresenteerd om orale neutrofielen op een manier analoog aan de mens te herstellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het meest kritische element in verband met het gebruik van het muriene ligatuur-geïnduceerde model van parodontitis is gecentreerd rond het vasthouden van de ligatuur tot het moment van opoffering of opzettelijke verwijdering. De geïnstalleerde biofilm-retentive ligatuur is in staat om een significant verlies van alveolaire bothoogte te induceren in slechts 6 dagen, met een en tussen de 11 – 16 dagen periode39. De beslissing om dierlijke proefpersonen op te offeren vóór de maximale periode v…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. W. C. wordt ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR). De auteurs willen Dr. Chunxiang Sun bedanken voor haar hulp bij het uitvoeren van de trypan Blue-kleuring.
Materials
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
Referenzen
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
- Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
- Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
- Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
- Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
- Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
- Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
- Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
- Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
- Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
- Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
- Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
- Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
- Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
- Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
- Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
- Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
- Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -. P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
- Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
- Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
- Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
- Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
- Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
- Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
- Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
- Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
- Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
- Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
- Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
- Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
- Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
- Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
- Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
- Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).
