מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים Murine להערכת הנויטרופילים אוראלי
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול להקמת מודל המושרה לקשירה של חניכיים מורטין מעורבים טוחנות הלסת הכפולה מרובים, וכתוצאה מכך אזורים גדולים יותר של רקמת חניכיים מעורב ועצם עבור ניתוח עוקבות, כמו גם השימוש מופחת בעלי חיים. טכניקה להערכת נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לנושאים אנושיים מתואר גם.
Abstract
היתרונות העיקריים של לימוד פתופסולוגיה של מחלת חניכיים ניצול מודלים murine הם עלות מופחתת של בעלי חיים, מערך של זנים מהונדסים גנטית, המספר המכריע של ניתוחים שניתן לבצע על שנקטפו ברקמות רכות וקשות. עם זאת, רבות ממערכות אלה כפופות לביקורות פרוצדורליות. כחלופה, המודל המושרה לקשירה של מחלת חניכיים, מונע על ידי פיתוח ושמירה של מיקרובידום אוראלי בלתי מהימן, יכול להיות מועסק, אשר המושרה במהירות ואמין יחסית. למרבה הצער, הווריאציות של פרוטוקול חניכיים murine הנגרמת לקשירה מבודדים לאזורים מוקד של החניכיים ובכפוף לציון בטרם עת של החיבור המותקן. זה ממזער את כמות הרקמה הזמינה לניתוחים הבאים ומגבירה את מספר בעלי החיים הנדרשים למחקר. פרוטוקול זה מתאר את המניפולציות המדויקות הדרושות כדי למקם ליגטורות טוחנת מורחבת עם שמירה ושימוש משופר של טכניקת לשטוף רומן לשחזר נויטרופילים אוראלי בעכברים עם גישה חלופית המשקל את השערים לעיל אתגרים טכניים.
Introduction
מחלת חניכיים (PD) היא מחלה אוסטאופתית הקשורה בתחלואה מארח משמעותי ונטל כלכלי, אשר מתבטא על ידי דלקת חניכיים ואובדן של שתי מצורף רקמה רכה ו osseous תמיכה עבור שיניים מושפעות1,2,3,4. תהליך זה נשלט על ידי אינטראקציות בין מיקרוביוטה אוראלי לבין המערכת החיסונית הטבועה של המארח. הוא קשור גם עם החרפה של מחלות דלקתיות אחרות כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם, סרטן5,6,7,8. מבחינה היסטורית, זה היה שיערו כי הפתוגנזה המשטרה תלויה בכמויות גדולות של חיידקים ספציפיים כגון פוררומונס חניכיים מסוים9. עם זאת, ראיות שאירעו לאחרונה מצביעות על כך שרכיב החיידקים של המשטרה מתווך על-ידי השימוש בסוגי השיניים. הביוilm היא קהילה מאורגנת ומורכבת של מיקרואורגניזמים רבים, שיכולים להתקיים במצב שיתופי והרסני בלתי-מצבי10,11. המבנה האוראלי מעניק בדרך כלל עמידות למחשב המארח על ידי מניעת הקמתה של החיידק הפתוגניים ומקדם את מבנה רקמת חניכיים אידיאלי ותפקוד באמצעות רגולציה של התגובה החיסונית מארח12,13. רטבאליות של היחסים equilibrious בין אורגניזמים בתוך חלל הפה ואת המערכת החיסונית מארח עלול להוביל שינויים בהומאוסטזיס רקמות, וכתוצאה מכך ההתפתחות של הופעות המחקר הקליני והרדיוגרפיה של המשטרה5,10,12,13,14.
מעניין, הקמת הדיסקטאוזיס אוראלי, בעוד הנדרש ליזום של PD, אינו מספיק כדי לנהוג במשטרה בכל האנשים, הימנעות לקראת היכולת של התגובה החיסונית מארח לחתור במעבר של microbiota בין שיתופי ודיסביוטית מדינות15. זה מציב זרקור מסוים על האמצעים שבהם המשטרה משפיעה על אחד הדמויות המובילות של מערכת החיסון המולדת, כלומר הפולימיוולוייט (pmn), או נויטרופילים, מתוך פרספקטיבות מקומיות מערכתית16,17.
בבני אדם, PMNs מגויסים מהמחזור בקצב של ~ 2 x 106 תאים/h ברקמות החיבור חניכיים בריאים, שם הם האוכלוסייה הלוקוציט בעלת הדירוג. כאן, הם גורשו לאחר מכן מן החניכיים sulcus לתוך חלל אוראלי כרכיב של נוזל חניכיים crevicular. בנוכחות המשטרה, נויטרופילים מתבטא בתוך מחזור הדם וחלל הפה, שבו התאים האלה אפקטור להחזיק פנוטיפ היפרסטרומה שמוביל להרס הנ ל של החניכיים17,18,19,20,21,22. לכן, הבנת התפקיד של PMNs ב PD ומצבים דלקתיים אחרים מערכתית הוא בעל חשיבות עליונה.
למרות שהוא מקובל שמחלות כרוניות מקושרות באופן הדדי למשטרה, המנגנונים הבסיסיים עדיין לא הגיעו לידי בקשה, ותורמים לקשיים בניהול התנאים הללו והקטלניים. מספר מודלים בעלי חיים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות ייחודיים, כבר נוצל לחקור את הפתופסולוגיה של PD23,24. התמקדות ספציפית על דגמי murine, ישנם מגוון של פרוטוקולים שדרכם לימוד של PD הוא הקלה; עם זאת, הם בעלי מספר חסרונות טכניים ופיזיולוגיים25,26,27,28,29,30,31.
הראשון, gavage אוראלי מודל העכבר דורש רבים אוראלי החיסונים של פתוגנים חניכיים אנושיים כדי ליצור דלקת חניכיים ואובדן העצם. בנוסף, הוא בדרך כלל לפניו על ידי תקופה של טיפול אנטיביוטי כדי לחתור תחת המודר מורלין פלורה אוראלי25. מודל זה דורש לעתים קרובות הכשרה מיוחדת לבצע בבטחה את gavage אוראלי, משתמשת רק חלק קטן של פתוגנים חניכיים מתוך microbiome האנושית מורכבים יותר, ודורש מספר חודשים כדי ליצור אובדן העצם מכתשיים.
לעומת זאת, המושרה כימית מודלים murine לנצל את מסירת אוראלי של חומצה sulfonic בנזן (TNBS) או הנתרן דטרן סולפט (DSS), סוכני בשימוש נפוץ בהקמת מודלים murine של קוליטיס על פני תקופה של מספר חודשים כדי לגרום לאובדן העצם חניכיים26. מודלים מבוססי פנים וחוץ לפנים הינם זמינים, אשר כרוכים בחותכות murine ורקמות של dorsum, כמו גם calvarium, בהתאמה. במודל מורסה לשעבר, כמה זריקות של חיידקים מנוהלים, יצירת אבצס חניכיים מרובים ומחסור של אובדן העצם מכתשיים, הגבלת השימוש שלהם במחקר של PD. הדגמים האחרונים מורסה מתאים יותר באופן משמעותי כדי ללמוד התקפה בקטריאלי, דלקת, וספיגת עצם באתרים מחוץ לחלל הפה, אשר מבטלת את ההערכה של החניכיים ומיקרובידום בעל פה27,28,29,30,31.
באמצעות מודל המושרה לקשירה של חניכיים, תפר ממשי קלוע הותקנה בדרך כלל סביב הטוחנת השנייה. כחלופה, מקטע ליניארי אחד של חומר תפר ניתן להוסיף בין הראשון והשני טוחנות32,33. המטרה של מיקום לקשירה היא להקל על הצטברות חיידקים וליצור דיסביוזיס בתוך חניכיים sulci, וכתוצאה מכך דלקת חניכיים והשמדת הרקמות ההלחנה של החניכיים. בעיקר, מודל זה מסוגל לייצר משמעותית יותר מכתשיים אובדן העצם בהשוואה לgavage הנפוץ יותר בשימוש אוראלי דגם34. עוד מסבך את השימוש במודל gavage אוראלי הוא ההתנגדות הטבעית על ידי מספר זנים של עכברים (כלומר, C57BL/6) כדי לפתח אובדן העצם מכתשיים. זה גם בעייתי, כמו זן זה הוא הנפוץ ביותר בתחום מחקר בעלי חיים מבוסס מורלין35.
הליכים קיימים המתוארים על-ידי מרצ ואח ‘ ואייב והאג שנגלי המציאו כדי לפשט את הפעולה הטכנית של הצבת ליגטורה33,36. למרבה הצער, הפרוטוקול לשעבר דורש מיוחדות 3D ציוד מודפס, בעלי פוטנציאל אובדן לקשירה מוקדמת, ובכך להגדיל את השימוש בעלי חיים ואת העלויות הקשורות בזמן נוסף שהושקע בחדר הניתוח. יתר על כן, שני הפרוטוקולים מייצרים רק אזורים קטנים של החניכיים החולים זמין למחקר.
היתרונות הטמונים בטכניקה זו מבוססים על מחקר סימולטני של ביוביוזיס ואימונולוגיה ששולטים על החניכיים, ניצול של בעלי חיים בעלי עלות נמוכה עם רקעים גנטיים מגוונים, ושיטות דיור פשוטות ובעלי גידול. ככאלה, על המטרות להיות מגדילים את הכרכים של הרקמה החולה, ובניסיונות לתרגל את עקרונות הירידה במחקר בעלי חיים, לצמצם את צריכת החיות לרמה נמוכה ככל האפשר. זה דורש להבטיח כי כל בעלי החיים מסוגלים להיכלל בניתוח ניסיוני37. עם זאת, יש לציין כי לא משנה איזה מודל בעלי חיים של מחלת חניכיים מנוצל, אין מודל יחיד המקיף את כל האלמנט של משטרת האנושות pathפסיולוגיה.
פרוטוקול חדש זה מפעיל את המיקום של ליגטורה סביב שיניים מרובות מקסימום הלסת הטוחנת באמצעות מיכשור וחומרים שנמצאים ברוב המעבדות. זה מאפשר כמות מספקת של זמן בקלות ובביטחון להתקין ליגטורה כי סביר avulse בטרם עת. בסופו של דבר, כמו PMNs לבצע את ההרס של החניכיים במשטרה, מתודולוגיה הרומן לשחזר נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לבני אדם מוצג גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
האלמנט הקריטי ביותר המשויך לשימוש של מודל המושרה לקשירה murine של חניכיים ממורכז סביב שמירה של ליגטורה עד לזמן ההקרבה או הסרה מכוונת. החיבור המותקן-רגיש פרטים-הקשירה מסוגל לגרימת אובדן משמעותי של גובה העצם מכתשיים כמו 6 ימים, את בין 11 – 16 תקופת היום39. ההחלטה להקריב נושאי בעלי חיי?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ג. וו. סי נתמך על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). המחברים רוצים להודות ד ר Chunxiang Sun על הסיוע שלה בביצוע הטריכתמים כחול.
Materials
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
Referenzen
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
- Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
- Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
- Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
- Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
- Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
- Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
- Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
- Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
- Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
- Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
- Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
- Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
- Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
- Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
- Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
- Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
- Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -. P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
- Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
- Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
- Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
- Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
- Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
- Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
- Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
- Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
- Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
- Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
- Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
- Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
- Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
- Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
- Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
- Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).
