口腔好中球評価のためのマウス歯肉炎の堅牢な合字誘発モデル
Summary
この記事では、複数の上顎大臼歯を含む糸字誘発モデルを確立するためのプロトコルを提示し、その後の分析と動物の使用量の減少のために関与する歯肉組織および骨のより大きな領域をもたらす。ヒト被験者に類似した方法で経口好中球を評価する技術も記載されている。
Abstract
マウスモデルを利用して歯周病の病態生理学を研究する主な利点は、動物のコストの削減、遺伝子組み換え株の配列、収穫された柔らかい組織および硬質組織に対して行うことができる膨大な数の分析である。しかし、これらのシステムの多くは手続き上の批判の対象となります。代替として、生理周期疾患の合字誘発モデルは、生体生物的経口微生物叢の局所的な発達および保持によって駆動され、急速に誘導され、比較的信頼性が高い、採用することができる。残念ながら、合字誘発性マウス歯炎プロトコルの変異体は、歯素の焦点領域に単離され、インストールされた合字の早期発従の対象となる。これにより、後続の分析に使用できる組織の量が最小限に抑え、研究に必要な動物の数が増加します。このプロトコルは、前述を緩和する代替アプローチを用いてマウスの口腔好中球を回収する新しいリンス技術の保持と使用を改善した拡張モル合字を配置するために必要な正確な操作を記述します。技術的な課題。
Introduction
歯周病(PD)は、有意な宿主罹患率および経済的負担に関連する骨溶解状態であり、歯肉の炎症および軟部組織結合および患部の骨の支持の両方の喪失によって現れる1、2、3、4である。このプロセスは、宿主の経口微生物叢と自然免疫系との相互作用によって支配される。また、糖尿病、心血管疾患、および癌5、6、7、8を含む他の全身性炎症性疾患の悪化に関連する。歴史的に、PD病因はポルフィロモナス・ギンギバリス9のような特定の細菌に大量に依存していると仮定した。しかしながら、最近の証拠は、PDの微生物成分が歯科バイオフィルムによって媒介されることを示唆している。バイオフィルムは、健康な共生および破壊的な生生物状態10、11に存在し得る多数の微生物の組織化された複雑なコミュニティである。経口バイオフィルムは、通常、病原性細菌の病巣の樹立を防止することによって宿主に耐性を与え、宿主免疫応答12、13の調節を通じて理想的な歯肉組織の構造および機能を促進する。口腔内の単一生物と宿主免疫系との間の平衡関係の摂動は、組織恒常性の変化をもたらし、その結果、PD5、10、12、13、14の顕著な臨床および放射線出現の特徴的な臨床および放射線出現の発症をもたらし得る。
興味深いことに、経口ジスバクテリア症の確立は、PDの開始に必要であるが、全ての個体においてPDを駆動するのに十分ではなく、共生およびジビオティック状態間の微生物叢の移行を覆す宿主免疫応答の能力に向かって排除する15。これは、PDが先天性免疫系の主要なキャラクターの1つ、すなわち多形核顆粒球(PMN)、または好中球に影響を与える手段に特定のスポットライトを置き、局所的および全身的な観点から16、17を置く。
ヒトでは、PMNは、健康な歯周結合組織において〜2x106細胞/hの割合で循環からリクルートされ、そこでは白血球集団が優勢である。ここで、それらは、その後、歯肉管管液の成分として口腔内に歯肉溝から排出される。PDの存在下で、好中球症は循環および口腔内に現れ、これらのエフェクター細胞は、歯周期17、18、19、20、21、22の前述の破壊につながる過剰炎症表現型を有する。したがって、PDおよび他の全身性炎症状態におけるPMNの役割を理解することは最も重要である。
慢性疾患がPDと相互に関連していることは広く受け入れられているが、根本的なメカニズムはまだ解明されておらず、これらの病的で致命的な全身状態の管理における困難に寄与している。複数の実験動物モデルは、それぞれ独自の長所と短所を有し、PD23、24の病態生理学を研究するために利用されている。特にマウスモデルに焦点を当てて、PDの研究が容易になる様々なプロトコルがあります。しかし、彼らはいくつかの技術的および生理学的な欠点を持っています25,26,27,28,29,30,31.
まず、口腔ガバゲージマウスモデルは、歯肉炎症および骨損失を生成するためにヒト歯周病原体の多数の経口接種を必要とする。加して、一般に、マウスの口腔内細菌叢25を覆す抗生物質治療の期間が先行する。このモデルは、多くの場合、経口ガベを安全に行うために専門的な訓練を必要とし、より複雑なヒト経口微生物から歯周病原体のほんの一部のみを使用し、肺胞骨喪失を確立するために数ヶ月を必要とします。
対照的に、化学的に誘導されたマウスモデルは、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)またはデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の経口送達を利用し、歯周骨損失26を誘発するために数ヶ月にわたって大腸炎のマウスモデルを確立するのに一般的に使用される薬剤である。口腔内および口腔外膿瘍ベースのモデルは、それぞれカルバリウムと同様に、モルサムのマウス切開器および組織を含む利用可能である。前者の膿瘍モデルでは、細菌のいくつかの注射が投与され、複数の歯肉膿瘍および歯槽骨喪失の消滅を引き起こし、PDの研究におけるその使用を制限する。後者の膿瘍モデルは、口腔外の部位における細菌毒性、炎症、および骨吸収を研究する傾向が有意に高く、歯竜菌および口腔微生物叢の評価を排除する27、28、29、30、31である。
歯周炎の合字誘発モデルを用いて、編組シルク縫合糸は、一般的に第2の大臼歯の周りに円周に設置されている。代替として、縫合材料の単一の線形セグメントは、第1および第2の臼歯32、33の間に挿入することができる。合字配置の目的は、細菌の蓄積を促進し、歯肉スルチ内のジスバイオシスを生成し、歯周組織の炎症および歯周を構成する組織の破壊をもたらすことである。最も顕著なのは、このモデルは、より一般的に使用される経口ガバゲージモデル34と比較して有意により多くの肺胞骨損失を産生することができる。さらに口腔ガベモデルの使用を複雑にすることは、歯槽骨損失を発症するマウスのいくつかの株(すなわち、C57BL/6)による自然な耐性である。この株は、マウスベースの動物研究35で最も頻繁に使用されるので、これはまた問題です。
マルケサンら、安倍、ハジシェンガリスによって記述された既存の手順は、合字33、36を配置する技術的な行為を簡素化するために考案されました。残念ながら、前者のプロトコルは、特殊な3Dプリント機器を必要とし、それによって動物の使用と手術室で費やされた追加の時間に関連するコストを増加させる早期合字損失の可能性を有しています。さらに、両方のプロトコルは、研究のために利用可能な疾患歯当ての小さな領域のみを生成します。
この技術に伴う利点は、歯竜を支配する経口ジスビオシスと免疫学の同時研究、多様な遺伝的背景を持つ低コストの動物の利用、シンプルな住宅と畜産の実践に基づいています。そのため、疾患組織の量を最大化し、動物研究における減少の原則を実践しようとする試みにおいて、動物の消費量を可能な限り低いレベルに減らすことが目標となるべきである。これには、すべての動物が実験分析37に含まれる能力を確保する必要があります。しかしながら、歯周病のどの動物モデルが利用されても、ヒトPD病態生理学のあらゆる要素を包含する単一のモデルがないことに留意すべきである。
この新しいプロトコルは、ほとんどの実験室で見られる計装および材料を使用して、複数の上顎臼歯の周りの合字の配置を採用しています。これは、早期に発芽する可能性が低い合字を簡単かつ自信を持ってインストールするのに十分な時間を可能にします。最後に、PMNがPDにおける歯素の破壊を調整するにつれて、ヒトに類似した方法で経口好中球を回収する新しい方法論も提示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
歯周炎のマウス合字誘発モデルの使用に関連する最も重要な要素は、犠牲または意図的な除去の時まで合字の保持を中心とする。設置されたバイオフィルム-リテンション合字は、わずか6日間で歯槽骨の高さの有意な損失を誘導することができ、11〜16日周期39の間に高原化する。骨損失の最大期間の前に動物の被験者を犠牲にするという決定は、合字誘発歯炎のはるかに短?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. W. C. はカナダ保健研究所 (CIHR) の支援を受けています。著者たちは、トリパンブルー染色を行う際の彼女の支援に対して、春祥孫博士に感謝したいと思います。
Materials
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
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