Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

Summary

We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.

Abstract

De speekselklieren zijn een site van aanzienlijke belangstelling voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in meerdere aspecten van de menselijke ziekte. Een doel van de onderzoekers is het herstellen van de functie van klieren beschadigd door straling therapieën of als gevolg van pathologieën geassocieerd met het syndroom van Sjögren. Een tweede doel van de onderzoekers is het definiëren van de mechanismen waarmee virussen repliceren binnen klierweefsel waar ze dan toegang tot speeksel vloeistoffen belangrijk voor horizontale overdracht kunnen krijgen. Deze doelstellingen benadrukken de noodzaak van een robuuste en toegankelijke in vitro speekselklier model dat kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de bovengenoemde en aanverwante onderzoekgebieden. Hier bespreken we een eenvoudig protocol om epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren en ze in vitro te propageren. Ons protocol kan verder worden geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van individuele studies. Kort, speeksel weefsel is mechanisch en enzymatisch gescheiden om te isoleren van enkele cellen of kleine clusters van cellen. Selectie voor epitheliale cellen treedt op door plating op een kelder membraan matrix in de aanwezigheid van media geoptimaliseerd om epitheliale celgroei te bevorderen. Deze resulterende culturen kunnen worden gehandhaafd als driedimensionale clusters, aangeduid als “salispheres”, of gekweekt als een monolaag op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten. Dit protocol resulteert in de uitgroei van een heterogene populatie van voornamelijk epitheelcellen die kan worden gekweekt voor 5-8 passages (15-20 populatie doublings) voordat het cellulaire senescentie ondergaat.

Introduction

Bij zoogdieren zijn de speekselklieren ingedeeld in 3 paar grote speekselklieren: de parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Er bestaat ook een reeks van kleine klieren gelegen op de tong en verspreid over de mondholte¹. De belangrijkste klieren zijn verantwoordelijk voor het bulk volume van speeksel geproduceerd². Naast het verstrekken van antimicrobiële bescherming door uitgescheiden factoren, het speeksel is belangrijk in het proces van kauwen en smeren van voedsel als het passeert de slokdarm². Als zodanig, speekselklier dysfunctie vertegenwoordigt een medisch probleem waarbij patiënten die niet in staat zijn om voldoende speeksel te produceren meer vatbaar zijn voor het ontwikkelen van maladies zoals tandheelkundige holten of orale candidiasis³. Bovendien, verminderde speeksel resulteert in grotere moeilijkheden eten en verteerd voedsel met een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven.

De speekselklier dysfunctie is voornamelijk te vinden bij patiënten die lijden aan het syndroom van Sjögren, een auto-immuunstoornis of bij patiënten met hoofd-en nekkanker die bestraling van^{3,4,5, 6}. Beschadigde secretoire acini binnen de klieren als gevolg van auto-immuniteit of bestralingstherapie ondergaan geen zelf vernieuwing, wat resulteert in een patiënt leven met onherstelbare schade⁶. De studie van de speekselklieren heeft ook de aandacht of onderzoekers geïnteresseerd in mechanismen van virale pathogenese gegarnerd. Sommige pathogenen, zoals humaan cytomegalovirus (hcmv), voortdurend repliceren binnen de speekselklieren, die vervolgens het mogelijk maakt voor de overdracht van ontluikende virus naar een nieuwe gastheer via speeksel^7,8. Zo is er een onvervulde behoefte om robuuste en reproduceerbare in vitro modellen van speekselklier weefsel te ontwikkelen om een divers scala aan medische problemen aan te pakken en te begrijpen.

Verschillende modellen van het Murine speekselklier systeem zijn gebruikt als uitgangspunt voor het begrijpen en karakteriseren van de verschillende epitheelcellen die de speekselklieren vormen^9,10. Er bestaan duidelijke en grote verschillen tussen menselijke en muriene speekselklieren¹¹. Met name de humane holte klier is groter ten opzichte van de submandibulaire klier, terwijl de muis submandibulaire en holte veel vergelijkbaar zijn in grootte^1,2,11. Terwijl vereeuwigd menselijke submandibulaire cellijnen bestaat, er zijn grote bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet nauwkeurig het fenotype van het primaire weefsel en secundaire bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet daadwerkelijk worden afgeleid van speeksel epitheel zelf¹². Om deze redenen is er een belang en een noodzaak om primaire speeksel weefsel van de mens te bestuderen.

Hier beschrijven we een protocol om primaire epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren voor weefselkweek. Ons protocol is gebaseerd op de werken van Pringle et al. en Tran et al. met wijzigingen die zijn aangebracht om hun procedures over het algemeen te vereenvoudigen^13,14. Ten eerste, terwijl het Protocol van Tran et al. vraagt om een lange incubatietijd van vijf uur voor enzymatisch verteren van het speeksel weefsel, is ons gewijzigde protocol succesvol geweest met zo weinig als een incubatie van één uur, vergelijkbaar met die in Pringle et al. Ten tweede gebruiken we verschillende enzymen voor de spijsvertering van weefsels, met name we gebruiken geen trypsine zoals wordt gebruikt in het oorspronkelijke Tran et al.-Protocol, maar in plaats daarvan een mengsel van dispase en Collagenase gebruiken. We voorkomen dat trypsine in de eerste digestie stappen als een recente studie suggereerde dat de initiële vertering van het speeksel weefsel door trypsine resulteert in verminderde levensvatbaarheid van de cel, mogelijk door het verlies van een zeldzame stamcel populatie¹⁵. Ten slotte cultuur we de salispheres op het oppervlak van de kelder membraan matrix (BMM) met behulp van een commercieel beschikbare media oorspronkelijk geformuleerd voor de voortplanting van bronchiale epitheelcellen. Ons protocol kan worden gebruikt om speeksel cellen te isoleren van parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Deze cellen Express speeksel amylase en andere speeksel specifieke genen die erop wijzen dat ze een fenotype vergelijkbaar met dat van speeksel acineuze epitheelcellen⁷. We hebben met succes speeksel culturen gegenereerd uit > 50 primaire menselijke weefselmonsters met behulp van deze methodologie. Bovendien kunnen de primaire speeksel cellen gemakkelijk worden cryopreserved voor gebruik op een later tijdstip.

Protocol

Deze protocollen en studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de institutioneel Review Board van de Universiteit van Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, IRB protocol 2016-4183). Speeksel weefsel wordt gewoonlijk in veel hoofd-en nekchirurgische ingrepen door de hand gelopen en is meestal niet betrokken bij het maligne proces. Normaalgesproken wordt na verwijdering van de patiënt (Figuur 1a) binnen 2-4 h een vers verwijderd speekselklier weefsel gebruikt. <p class="jove_title…

Representative Results

Twee-drie dagen na het plating van cellen van verteerd weefsel op BMM, cellen zullen gemakkelijk vormen kleine clusters die zullen blijven uitbreiden in grootte tot 15-20 cellen per cluster (Figuur 2a). Cellulaire puin en losgekoppelde dode cellen worden meestal gezien en moeten worden verwijderd door aspireren en aanvullen met verse media. Cellen zullen blijven prolifereren als salispheres voor over 3-10 dagen, of zolang de BMM laag intact blijft. Af en toe,…

Discussion

Speeksel dysfunctie is een zorg voor de kwaliteit van leven voor mensen die lijden aan het syndroom van Sjögren, evenals degenen die radiotherapie ondergaan voor kankers naast de speekselklieren^3,4,^{5, 16}. Een voorgestelde therapie voor de behandeling van deze patiënten is om te groeien functionele speeksel stamcellen of organoïden in vitro, die vervolgens kunnen worden ingebracht in beschad…

Materials

100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI