Isolement des cellules épithéliales salivaires des glandes salivaires humaines pour la croissance in vitro comme Salispheres ou Monolayers

Summary

Nous présentons une méthode pour isoler et cultiver les cellules épithéliales salivaires humaines primaires dérivées. Ces cellules présentent des modèles d’expression génique compatibles avec le fait qu’elles soient d’origine épithéliale salivaire et peuvent être cultivées sous forme de salisphères sur des matrices de membrane de sous-sol dérivées de cellules tumorales Engelbreth-Holm-Swarm ou comme monocouches sur des plats de culture traités.

Abstract

Les glandes salivaires sont un site d’intérêt significatif pour les chercheurs intéressés par de multiples aspects de la maladie humaine. L’un des objectifs des chercheurs est de restaurer la fonction des glandes endommagées par les radiothérapies ou en raison de pathologies associées au syndrome de Sjâgren. Un deuxième objectif des chercheurs est de définir les mécanismes par lesquels les virus se répliquent dans les tissus glandulaires où ils peuvent ensuite accéder à des fluides salivaires importants pour la transmission horizontale. Ces objectifs soulignent la nécessité d’un modèle robuste et accessible de glande salivaire in vitro qui peut être utilisé par les chercheurs intéressés par ce qui précède ainsi que les domaines de recherche connexes. Ici nous discutons un protocole simple pour isoler les cellules épithéliales des glandes salivaires humaines et les propager in vitro. Notre protocole peut être optimisé pour répondre aux besoins des études individuelles. En bref, le tissu salivaire est séparé mécaniquement et enzymatiquement pour isoler les cellules simples ou les petits groupes de cellules. La sélection des cellules épithéliales se fait en placage sur une matrice de membrane de sous-sol en présence de médias optimisés pour favoriser la croissance épithéliale de cellules. Ces cultures résultantes peuvent être maintenues sous forme d’amas tridimensionnels, appelés « salispheres », ou cultivées en monocouche sur des plats de culture de tissus plastiques traités. Ce protocole entraîne la croissance d’une population hétérogène de cellules principalement épithéliales qui peuvent être propagées pour 5-8 passages (15-20 doubles de population) avant de subir la sénescence cellulaire.

Introduction

Chez les mammifères, les glandes salivaires sont organisées en 3 paires de glandes salivaires majeures : les glandes parotide, submandibulaires et sublinguales. Il existe également une série de glandes mineures situées sur la langue et dispersées dans la cavité buccale¹. Les principales glandes sont responsables du volume de salive produite². En plus de fournir une protection antimicrobienne par des facteurs sécrétés, la salive est importante dans le processus de mastication et de lubrification des aliments comme il passe à travers l’œsophage². En tant que tel, le dysfonctionnement des glandes salivaires représente un problème médical où les personnes atteintes qui sont incapables de produire suffisamment de salive sont plus enclins à développer des maladies telles que les caries dentaires ou la candidose orale³. De plus, la réduction de la salive entraîne une plus grande difficulté à manger et à digérer les aliments ayant un impact significatif sur la qualité de vie.

Le dysfonctionnement salivaire de glande est principalement trouvé dans les patients souffrant du syndrome de Sjàgren, un désordre autoimmun, ou dans les patients présentant le cancer de tête et de cou qui ont subi la thérapie d’irradiation^{3,4,5, 6}. Acini sécréteur endommagé dans les glandes à la suite de l’auto-immunité ou la radiothérapie ne subissent pas l’auto-renouvellement, ce qui entraîne un patient vivant avec des dommages irréversibles⁶. L’étude des glandes salivaires a également attiré l’attention ou les chercheurs intéressés par les mécanismes de la pathogénie virale. Certains agents pathogènes, comme le cytomégalovirus humain (HCMV), se reproduisent constamment dans les glandes salivaires, ce qui permet ensuite la transmission du virus naissant à un nouvel hôte via la salive^7,8. Ainsi, il y a un besoin non satisfait de développer des modèles in vitro robustes et reproductibles du tissu salivaire de glande pour aborder et comprendre un éventail divers de problèmes médicaux.

Plusieurs modèles du système salivaire de glande saurine ont été employés comme point de départ pour comprendre et caractériser les différentes cellules épithéliales qui forment les glandes salivaires^9,10. Il existe des différences évidentes et majeures entre les glandes salivaires humaines et maurines¹¹. Plus particulièrement la glande parotide humaine est plus grande par rapport à la glande submandibulaire tandis que la souris submandibulaire et parotide sont beaucoup semblables dans la taille^1,2,11. Bien qu’il existe des lignées cellulaires sous-mandibulaires humaines immortalisées, il existe des préoccupations majeures quant au fait que les cellules immortalisées ne maintiennent pas avec précision le phénotype du tissu primaire et les préoccupations secondaires selon lesquelles les cellules immortalisées ne sont pas réellement dérivées épithélium salivaire lui-même¹². Pour ces raisons, il ya un intérêt et un besoin d’étudier les tissus salivaires primaires de l’homme.

Ici nous décrivons un protocole pour isoler les cellules épithéliales primaires des glandes salivaires humaines pour la culture de tissu. Notre protocole est basé sur les travaux de Pringle et coll. et Tran et coll. avec des modifications apportées pour simplifier généralement leurs procédures^13,14. Tout d’abord, alors que le protocole de Tran et coll. exige une longue incubation de cinq heures pour digérer enzymatiquement le tissu salivaire, notre protocole modifié a été couronné de succès avec aussi peu qu’une heure d’incubation, semblable à celle de Pringle et al. Deuxièmement, nous utilisons différentes enzymes pour la digestion des tissus, plus particulièrement nous n’utilisons pas la trypsine comme il est utilisé dans le protocole original Tran et al., mais plutôt utiliser un mélange de dispase et de collagène. Nous préférons éviter la trypsine dans les étapes initiales de digestion comme une étude récente a suggéré que la digestion initiale du tissu salivaire par trypsine a comme conséquence la viabilité réduite de cellules, probablement par la perte d’une population rare de cellules souches^15. Enfin, nous culture les salispheres sur la surface de la matrice de membrane de sous-sol (BMM) en utilisant un support disponible dans le commerce à l’origine formulé pour la propagation des cellules épithéliales bronchiques. Notre protocole peut être employé pour isoler des cellules salivaires des glandes parotides, submandibulaires, et sublinguales. Ces cellules expriment l’amylase salivaire et d’autres gènes spécifiques salivaires indiquant qu’ellesmaintiennent un phénotype semblable à celui des cellules épithéliales acinar salivaires 7. Nous avons réussi à générer des cultures salivaires à partir d’échantillons de tissus humains primaires à partir de cette méthodologie. En outre, les cellules salivaires primaires peuvent facilement être cryoconservées pour une utilisation ultérieure.

Protocol

Ces protocoles et études ont été examinés et approuvés par la Commission d’examen institutionnel de l’Université de Cincinnati (#00003152 d’assurance à l’échelle fédérale, protocole de la CISR 2016-4183). Le tissu salivaire est généralement réséqué dans beaucoup de procédures chirurgicales de tête et de cou et est habituellement non impliqué par le processus malin. Typiquement, le tissu salivaire fraîchement réséqué de glande est employé dans les 2-4 h après déplacement du patient (<strong class=…

Representative Results

Deux à trois jours après le placage des cellules du tissu digéré sur le BMM, les cellules formeront facilement de petits amas qui continueront d’augmenter en taille jusqu’à 15-20 cellules par grappe (figure 2A). Les débris cellulaires et les cellules mortes détachées sont généralement vus et doivent être enlevés en s’améliorant et en se réapprovisionnant avec des milieuis frais. Les cellules continueront de proliférer sous forme de salisphères…

Discussion

Le dysfonctionnement salivaire représente une préoccupation pour la qualité de vie des personnes souffrant du syndrome de Sjâgren ainsi que de ceux qui subissent une radiothérapie pour les cancers adjacents aux glandes salivaires^{3,4,5, 16}. Une thérapie proposée pour traiter ces patients est de développer des cellules souches salivaires fonctionnelles ou des organoïdes in vitro, qui pe…

Materials

100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI