Isolierung von Speicheldrüsenepithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für In-Vitro-Wachstum als Speicheldrüsen oder Monolayer

Summary

Wir präsentieren eine Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Speicheldrüsen-abgeleiteten Epithelzellen. Diese Zellen zeigen Genexpressionsmuster, die mit ihrem Epithel-Ursprung übereinstimmen und können als Salisphären auf Kellermembranmatrizen aus Engelbreth-Holm-Schwarm-Tumorzellen oder als Monolayer auf behandelten Kulturgerichten angebaut werden.

Abstract

Die Speicheldrüsen sind ein Ort von erheblichem Interesse für Forscher, die an mehreren Aspekten der menschlichen Krankheit interessiert sind. Ein Ziel der Forscher ist es, die Funktion der Drüsen wiederherzustellen, die durch Strahlentherapien oder aufgrund von Pathologien im Zusammenhang mit dem Sjögren-Syndrom geschädigt sind. Ein zweites Ziel der Forscher ist es, die Mechanismen zu definieren, durch die sich Viren im Drüsengewebe replizieren, wo sie dann Zugang zu Speicheldrüsenflüssigkeiten erhalten können, die für die horizontale Übertragung wichtig sind. Diese Ziele unterstreichen die Notwendigkeit eines robusten und zugänglichen In-vitro-Speicheldrüsenmodells, das von Forschern genutzt werden kann, die sich für die oben genannten sowie verwandten Forschungsbereiche interessieren. Hier diskutieren wir ein einfaches Protokoll, um Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen zu isolieren und sie in vitro zu vermehren. Unser Protokoll kann weiter optimiert werden, um den Anforderungen einzelner Studien gerecht zu werden. Kurz gesagt, Speicheldrüsengewebe wird mechanisch und enzymatisch getrennt, um einzelne Zellen oder kleine Zellhaufen zu isolieren. Die Auswahl für Epithelzellen erfolgt durch Beschichtung auf einer Kellermembranmatrix in Gegenwart von Medien, die optimiert sind, um das Epithelzellwachstum zu fördern. Diese resultierenden Kulturen können als dreidimensionale Cluster, als “Salisphären” bezeichnet, oder als Monolayer auf behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichten angebaut werden. Dieses Protokoll führt zum Auswuchs einer heterogenen Population hauptsächlich epitheliale Zellen, die für 5-8 Passagen (15-20 Populationsverdoppelungen) propagiert werden können, bevor sie sich einer zellulären Seneszenz unterziehen.

Introduction

Bei Säugetieren sind die Speicheldrüsen in 3 Paare von Hauptspeicheldrüsen organisiert: die Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen. Es gibt auch eine Reihe von kleineren Drüsen auf der Zunge und verstreut in der Mundhöhle¹. Die Hauptdrüsen sind verantwortlich für das Massenvolumen des erzeugten Speichels². Neben dem antimikrobiellen Schutz durch sezernierte Faktoren ist der Speichel wichtig für den Prozess des Kauens und Schmierens von Lebensmitteln, während er durch die Speiseröhre geht². Als solche, Speicheldrüsenfunktionsstörungen stellt ein medizinisches Problem, wo Betroffene, die nicht in der Lage sind, genug Speichel zu produzieren sind anfälliger für die Entwicklung von Krankheiten wie Zahnhöhlen oder orale Candidiasis³. Darüber hinaus führt reduzierter Speichel zu größeren Schwierigkeiten beim Essen und Verdauen von Lebensmitteln, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensqualität haben.

Speicheldrüsenfunktionsstörungen finden sich vor allem bei Patienten mit Sjögren-Syndrom, einer Autoimmunerkrankung oder bei Patienten mit Kopf- und Nackenkrebs, die einer Bestrahlungstherapie unterzogen wurden^{3,4,5, 6}. Beschädigte sekretotische Acini in den Drüsen als Folge von Autoimmunität oder Strahlentherapie unterziehen sich keiner Selbsterneuerung, was dazu führt, dass ein Patient mit irreversiblen Schäden lebt⁶. Die Untersuchung von Speicheldrüsen hat auch die Aufmerksamkeit oder Forscher, die an Mechanismen der viralen Pathogenese interessiert. Einige Krankheitserreger, wie das menschliche Zytomegalievirus (HCMV), replizieren sich hartnäckig innerhalb der Speicheldrüsen, was dann die Übertragung des entstehenden Virus auf einen neuen Wirt über Speichel^7,8ermöglicht. Daher besteht ein unerfülltes Bedürfnis, robuste und reproduzierbare In-vitro-Modelle von Speicheldrüsengewebe zu entwickeln, um eine Vielzahl medizinischer Probleme anzugehen und zu verstehen.

Mehrere Modelle des murinen Speicheldrüsensystems wurden als Ausgangspunkt verwendet, um die verschiedenen Epithelzellen zu verstehen und zu charakterisieren, die die Speicheldrüsen^9,10bilden. Es gibt offensichtliche und große Unterschiede zwischen menschlichen und murinen Speicheldrüsen¹¹. Vor allem die menschliche Ohrspeicheldrüse ist größer im Verhältnis zur submandibulären Drüse, während die Maus submanddibuläre und Ohrspeicheldrüse sind viel ähnlich in Größe^1,2,11. Während verewigte menschliche submandibuläre Zelllinien existieren, gibt es große Bedenken, dass die verewigten Zellen den Phänotyp des primären Gewebes nicht genau aufrechterhalten, und sekundäre Bedenken, dass die verewigten Zellen nicht tatsächlich von Speichelepithel selbst¹². Aus diesen Gründen gibt es ein Interesse und die Notwendigkeit, primäre speicheldrüsengewebe vom Menschen zu studieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung primärer Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für die Gewebekultur. Unser Protokoll basiert auf den Arbeiten von Pringle et al. und Tran et al. mit Änderungen, die vorgenommen wurden, um ihre Verfahren generell zu vereinfachen^13,14. Erstens: Während das Protokoll von Tran et al. eine lange fünfstündige Inkubation zur enzymatischen Verdauung des Speicheldrüsengewebes fordert, war unser modifiziertes Protokoll mit nur einer Stunde Inkubation erfolgreich, ähnlich wie in Pringle et al. Zweitens verwenden wir verschiedene Enzyme für die Gewebeverdauung, vor allem verwenden wir Trypsin nicht, wie es im ursprünglichen Tran et al.-Protokoll verwendet wird, sondern verwenden eine Mischung aus Dispase und Kollagennase. Wir ziehen es vor, Trypsin in den ersten Verdauungsschritten zu vermeiden, da eine aktuelle Studie nahelegte, dass die Erstverdauung des Speichelgewebes durch Trypsin zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit führt, möglicherweise durch den Verlust einer seltenen Stammzellpopulation¹⁵. Schließlich bewirtschaften wir die Salisphären auf der Oberfläche der Kellermembranmatrix (BMM) mit einem kommerziell erhältlichen Medium, das ursprünglich für die Ausbreitung von Bronchialepithelzellen entwickelt wurde. Unser Protokoll kann verwendet werden, um Speicheldrüsenzellen aus Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen zu isolieren. Diese Zellen drücken Speicheldrüsenamylase und andere Speicheldrüsen-spezifische Gene aus, was darauf hindeutet, dass sie einen Phänotyp beibehalten, der dem von Speicheldrüsen-Acinar-Epithelzellen^{ähnelt 7}. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Speicheldrüsenkulturen aus >50 primären menschlichen Gewebeproben erzeugt. Darüber hinaus können die primären Speicheldrüsenzellen leicht kryokonserviert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden.

Protocol

Diese Protokolle und Studien wurden vom Institutional Review Board der Universität Cincinnati überprüft und genehmigt (Federal-wide Assurance #00003152, IRB-Protokoll 2016-4183). Speichelgewebe wird häufig in vielen Kopf-und Hals chirurgische nusziert und ist in der Regel unbeteiligtdurcht durch den bösartigen Prozess. Typischerweise wird frisch resektiertes Speicheldrüsengewebe innerhalb von 2-4 h nach der Entfernung vom Patienten verwendet (Abbildung 1A). 1….

Representative Results

Zwei-drei Tage nach der Beschichtung von Zellen aus verdautem Gewebe auf BMM bilden Zellen leicht kleine Cluster, die sich weiterhin in der Größe von bis zu 15-20 Zellen pro Cluster ausdehnen werden (Abbildung 2A). Zelluläre Trümmer und abgetrennte abgestorbene Zellen sind in der Regel zu sehen und sollten durch Ansaugen und Auffüllen mit frischen Medien entfernt werden. Zellen werden sich als Salisphären für etwa 3-10 Tage weiter ausbreiten, oder sola…

Discussion

Salivary Dysfunktion stellt ein Anliegen für die Lebensqualität für diejenigen, die mit Sjögren-Syndrom sowie diejenigen, die Strahlentherapie für Krebse neben den Speicheldrüsen^{3,4,5, 16}. Eine vorgeschlagene Therapie zur Behandlung dieser Patienten ist das Anwachsen funktioneller Speichelstammzellen oder Organoide in vitro, die dann in beschädigte Speicheldrüse eingeführt werden kön…

Materials

100 mm culture dishes	Thermo Scientific	172931
15 mL conical tubes	Thermo Scientific	339651
50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh	Fisher	22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum	Gibco	12676-029
Collagenase type III	Worthington	LS004182	Store at 4 °C.
Cryogenic Tube	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Dulbecco phosphate buffered saline	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Basement membrane extract	Cultrex	3432-005-01	Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes	Falcon	353046
Surgical forceps	Fisher	22-079-742
Trypsin-EDTA solution	Corning	25-052-CI