تنقيه الS100A12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقه تنقيه لبروتين الكالسيوم الخالي من العلامات المؤتلف S100A12 والقلة المستحثة بالأيونات لاختبارات تحفيز البويضات البشرية.
Abstract
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لتنقيه الإنسان الكالسيوم ملزمه البروتين S100A12 ولها الأيونات الناجمة عن الايونيه من الثقافة القولونية لتحفيز الخلايا المناعية. ويستند هذا البروتوكول علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تشمل البروتين قبل تنقيه علي عمود اللوني التبادل انيون وخطوه تلميع اللاحقة علي عمود التفاعل مسعور. وتنتج هذه الاستراتيجية S100A12 بروتين عالي النقاء والغلة بتكاليف يمكن التحكم فيها. لاختبارات وظيفية علي الخلايا المناعية بقايا في نهاية المطاف التلوث اندوتوكسين يتطلب الرصد الدقيق والمزيد من الخطوات التنظيف للحصول علي البروتين الخالي من اندوتوكسين. ويمكن استبعاد غالبيه تلوث السمية المعوية من خلال الفصل اللوني لتبادل انيون. لاستنفاد تلوث المتبقية ، يصف هذا البروتوكول خطوه أزاله مع مرشحات الطرد المركزي. اعتمادا علي القوه الأيون المتاحة S100A12 يمكن ان يرتب في homomultimers مختلفه. وللتحقيق في العلاقة بين الهيكل والوظيفة ، يصف هذا البروتوكول أيضا المعالجة الايونيه للبروتين S100A12 التي تليها الوصلات الكيميائية لتحقيق الاستقرار S100A12 قله المواليد وانفصالها اللاحق بالحجم-الاستبعاد اللوني. وأخيرا ، فاننا نقوم بوصف الفحص القائم علي الخلايا الذي يؤكد النشاط البيولوجي للبروتين المنقي ويؤكد التحضير الخالي من LPS.
Introduction
S100A12 هو بروتين ملزم الكالسيوم الذي يتم إنتاجه في الغالب من قبل المحببات البشرية. يتم الإفراط في البروتين خلال (الجهازية) التهاب ومستويات المصل ، وخاصه في (السيارات) الامراض التهابيه مثل التهاب المفاصل الجهازية الاحداث مجهول الشكل (sJIA) ، حمي البحر الأبيض المتوسط العائلية (FMF) أو مرض كاواساكي (KD) يمكن ان تبلغ عن نشاط المرض والاستجابة للعلاج. اعتمادا علي مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs) مثل المستقبلات مثل الحصيلة (TLRs) ، يمكن تنشيط الجهاز المناعي الفطري من الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) مثل الليبوكوليساشاريدس (LPS) أو تلف الأنماط الجزيئية المرتبطة (DAMPs; ويطلق عليه أيضا اسم “الاردقائق”. DAMPs هي جزيئات الذاتية مثل البروتينات الخلوية ، والدهون أو الأحماض النووية1. ووصفت بشكل جيد وظائف رطبه لأعضاء عائله البروتين كالغرولين ، S100A8/A9 و S100A122، والتي يتم أيضا الإبلاغ عنها للعمل كمعدن ثنائي التكافؤ الأيونات المضادة للميكروبات الببتيدات3،4، 5,6. [دبندينغ ون] ال يتوفر أيون قوه S100A12 علبه, مثل أخرى أعضاء من ال S100 أسره, يرتب داخل [هوميمرمررس] مختلفه وحتى مؤخرا التاثير من [S100A12-اوليغمرايشن] علي [بر]-تفاعل, بشكل خاص TLR4, كان مجهوله.
يتكون البروتين الأحادي الشكل (92 الأحماض الامينيه ، 10.2 كده) من اثنين من الهياكل الحلزونية اللولبية المتصلة بواسطة رابط مرن. و C-الطرفية ef-اليد يحتوي علي الكلاسيكية Ca2 +-ربط عزر في حين ان N-الطرفية ef-اليد يسلك هيكل حلقه موسعه البروتين الخاصة S100 (‘ الزائفة-ef-اليد ‘) ويكشف انخفاض Ca2 +-تقارب. Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 يمكن ان تحفز علي تغيير المطابقة الرئيسية في البروتينات ‘ C-المحطة ، مما يؤدي إلى التعرض لرقعه مسعورة علي كل مونومر ويشكل واجهه ديميريشن. وهكذا ، في ظل الظروف الفسيولوجية ، أصغر هيكل رباعي شكلتها S100A12 هو ديمر غير التكافؤ (ما يقرب من 21 كده) فيها مونومرات الفردية في اتجاه مضاد للمتوازي. عندما رتبت كما dimer, وذكرت S100A12 لتنحيه الزنك2 + فضلا عن غيرها من أيونات المعادن ثنائي التكافؤ, علي سبيل المثال, Cu2 + مع تقارب عاليه7. وتنسق هذه الأيونات في واجهه S100A12 ديمر بواسطة الأحماض الامينيه H15 وD25 الوحدة الفرعية واحده وH85 فضلا عن H89 الفرعية الأخرى8,9,10المضادة لمتوازي الأضلاع. في حين ان الدراسات السابقة تقترح ان الزنك2 +-تحميل S100A12 قد تحفز منظمه البروتين إلى الإنسان-الترام (44 كده) ويؤدي إلى زيادة Ca2 +-تقارب11,12, المعايرة الاخيره المعادن دراسات6 تشير Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 لزيادة تقارب البروتين إلى الزنك2 +. مره واحده S100A12 EF-الأيدي التي احتلت بالبالكامل من قبل Ca2 +، ويعتقد ca2 + اضافيه للربط بين الدمامل ، مما اثار تشكيل hexamer (حوالي 63 كده). ومن الواضح ان البنية المعمارية للهيكل السداسي الأضلاع مختلفه عن الهيكل الرباعي. ومن المقترح ان يتم تعطيل واجهه رباعيه لتؤدي إلى واجات dimer-dimer الجديدة التي تفيد تشكيل hexamer10. يتم التعبير عن S100A12 بشكل حصري تقريبا من قبل المحببات البشرية حيث تشكل حوالي 5 ٪ من جميع البروتين السيتووليك13. في وظيفته رطبه S100A12 وصفت تاريخيا بأنه ناهض من متعددة ligand مستقبلات للمنتجات النهائية glycation المتقدمة (الغضب) ، ثم وصفت حديثا خارج الخلية المعروفة الغضب البروتين ملزمه (EN-الغضب)14. وان كنا قد أبلغت في وقت سابق S100A12 البيوكيميائية لكل من الغضب و TLR415، ونحن أظهرت مؤخرا الخلايا الاحاديه الإنسان للرد علي التحفيز S100A12 بطريقه تعتمد علي TLR416. وهذا يتطلب ترتيب S100A12 في المرجع المصدق2 +/Zn2 +-المستحثة سداسي الأضلاع هيكل كوارتيراري16.
هنا نحن وصف اجراء تنقيه لS100A12 البشرية المؤتلف والتي يسببها الأيونات لتحفيز الخلايا المناعية16,17. ويستند هذا علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تتضمن في البداية عمود انيون-تبادل لعزل وتركيز البروتين وأزاله التلوث السائبة (علي سبيل المثال ، اندوتوكسين/ليبووليساشاريدس)18. راتنجات الفصل اللوني للتبادل الأيوني بروتينات منفصلة علي أساس مختلف صافي الرسوم السطحية. للبروتينات الحمضية مثل S100A12 (نقطه ايزوالكتريك من 5.81) ، ونظام العازلة مع درجه الحموضة من 8.5 وقويه انيون-تبادل الراتنج يؤدي إلى فصل جيد. تم التملص من البروتينات المنضمة مع التدرج العازلة عاليه الملح. مع زيادة الأيونات السلبية قوه الايونيه في العازلة التهرب تتنافس مع البروتينات للرسوم علي سطح الراتنج. البروتينات بشكل فردي الوت اعتمادا علي صافي التهمه ونتيجة لذلك ، والمخازن المؤقتة الموصوفة هنا تسمح لعزل وتركيز البروتين S100A12 الإفراط في التعبير. بسبب الجماعات المشحونة سلبا في الليبووليساشاريدس ، ترتبط هذه الجزيئات أيضا إلى راتنجات التبادل انيون. ومع ذلك ، فان ارتفاع الرسوم الصافية يؤدي إلى التملص في وقت لاحق في التدرج عاليه الملح المطبق. وقد تم إدخال الخطوة الثانية من اجراء تنقيه لتلميع الأغراض. وهذا يجعل استخدام قدره ربط الكالسيوم من S100A12 ويزيل الشوائب المتبقية علي عمود التفاعل مسعور. الكالسيوم ملزمه من S100A12 يؤدي إلى تغيير المطابقة والتعرض للبقع مسعور علي سطح البروتين. علي هذا الشرط ، يتفاعل S100A12 مع سطح مسعور من الراتنج. علي الكالسيوم-chelating من قبل أدتا ، يتم عكس هذا التفاعل. في وجود الأيونات ، وخاصه الكالسيوم والزنك ، S100A12 يرتب في الأقليات homomeric. لدراسة هيكل العلاقات وظيفة من القلة المختلفة ، ونحن استقرت ديميريك ، رباعيه الS100A12 والمؤتلف هيكاميرك مع الرابط الكيميائية وفصل المجمعات علي عمود اللوني الاستبعاد الحجم. وأخيرا ، لتحليل الأداء الوظيفي والنشاط البيولوجي للبروتين المنقي والقلة المستحثة بالأيونات ، يمكن مقارنه الإصدار الخلوي من S100A12 و LPS الذي يحفز البويضة الاحاديه.
وقد وصفت طرق مختلفه لتنقيه S100A12 حتى الآن. وعلي سبيل المثال ، نشر جاكسون وآخرون19بروتوكولا بالتنقية عن طريق عمود التبادل انيون والفصل اللوني اللاحق لحجم الاستبعاد. تلميع تنقيه علي عمود الحجم الاستبعاد يؤدي إلى نتائج جيده ، ولكن-بسبب علي سبيل المثال احجام التحميل محدوده-اقل مرونة في قابليه التحجيم. نهج مختلف ، نشرتها قبله وآخرون20، يصف تنقيه البروتين الموسومة عن طريق Ni2 + عمود التقارب كخطوه تنقيه الاولي ، تليها الانقسام الانزيمي لأزاله العلامة والمزيد من خطوات تنقيه. علي النقيض من الدراسات aforecited19،20، يتم تحديد البروتين المنتجة كما هو موضح في هذا البروتوكول للتجارب علي الخلايا المناعية. ولذلك ، فان بقايا التسمم المعوي من الثقافة البكتيرية هو تحد. علي الرغم من انه قد تم وصف النهج المختلفة لأزاله الذيفان المعوي حتى الآن ، لا توجد طريقه موحده تعمل بشكل جيد علي قدم المساواة لأي محلول بروتين معين21،22.
وباختصار ، فان بروتوكولنا يجمع بين مزايا التعبير الخالي من العلامات في نظام بكتيري مع أزاله اندوتوكسين فعاله والغلة العالية من البروتين النقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف خاليه من العلامات البكتيرية التعبير عن S100A12 الإنسان وتنقيتها ، فضلا عن الانفصال في مختلف الأيونات الناجمة عن الايونيه لتحفيز الخلايا المناعية. بالمقارنة مع المؤلفات المنشورة علي S100A12 تنقيه البروتين8،23،24، واس…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكانت هذه الدراسة مدعومة بمنح من برنامج البحوث الطبية المبتكرة داخل كليه الطب بجامعه مونستر (KE121201 إلى سي كي) ومؤسسه البحوث المانيه (DFG ، Fo354/3-1 إلى D.F).
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
Referenzen
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. . Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. . Application Note – Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation – The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
