Reinigung des menschlichen S100A12 und seiner Ionen-induzierten Oligomere zur Immunzellstimulation
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Reinigungsmethode für rekombinantes tagfreies Calciumbindungsprotein S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für humane Monozytenstimulationstests.
Abstract
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Reinigung des humanen Calcium-bindenden Proteins S100A12 und seiner ioneninduzierten Oligomere aus der Escherichia coli-Kultur für Immunzellstimulationen. Dieses Protokoll basiert auf einer zweistufigen Chromatographiestrategie, die die Proteinvorreinigung auf einer Anionenaustauschchromatographiesäule und einen anschließenden Polierschritt auf einer hydrophoben Wechselwirkungssäule umfasst. Diese Strategie produziert S100A12 Protein von hoher Reinheit und Ausbeute zu überschaubaren Kosten. Für funktionelle Tests an Immunzellen erfordert eine eventuelle Rest-Endotoxin-Kontamination eine sorgfältige Überwachung und weitere Reinigungsschritte, um endotoxinfreies Protein zu erhalten. Die mehralsige Endotoxinkontamination kann durch Anionenaustauschchromatographie ausgeschlossen werden. Um Restkontaminationen zu beseitigen, beschreibt dieses Protokoll einen Entfernungsschritt mit Zentrifugalfiltern. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12 in verschiedene Homomultimere anordnen. Um das Verhältnis zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, beschreibt dieses Protokoll die Ionenbehandlung von S100A12-Protein enden, gefolgt von chemischer Vernetzung zur Stabilisierung von S100A12-Oligomeren und deren anschließender Trennung durch Größenausschluss. Chromatographie. Schließlich beschreiben wir einen zellbasierten Assay, der die biologische Aktivität des gereinigten Proteins bestätigt und die LPS-freie Zubereitung bestätigt.
Introduction
S100A12 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das überwiegend von menschlichen Granulozyten produziert wird. Das Protein wird während (systemischer) Entzündungen überexprimiert und sein Serumspiegel, insbesondere bei (auto)entzündlichen Erkrankungen wie systemischer juveniler idiopathischer Arthritis (sJIA), familiärem Mittelmeerfieber (FMF) oder Kawasaki-Krankheit (KD) Krankheitsaktivität und Reaktion auf die Therapie. Abhängig von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie gebührenähnlichen Rezeptoren (TLRs) kann das angeborene Immunsystem durch pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) wie Lipopolysaccharide (LPS) oder Schäden an assoziierten molekularen Mustern (DAMPs; auch als “Alarmins” bezeichnet). DAMPs sind endogene Moleküle wie zelluläre Proteine, Lipide oder Nukleinsäuren1. DAMP-Funktionen sind für die Mitglieder der Calgranulin-Proteinfamilie, S100A8/A9 und S100A122, die auch als divalente metallionchelisierende antimikrobielle Peptide 3,4, 5,6. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12, wie andere Mitglieder der S100-Familie, in verschiedene Homomultimere einwirken und bis vor kurzem waren die Auswirkungen der S100A12-Oligomerisierung auf die PRR-Interaktion, insbesondere TLR4, unbekannt.
Die monomere Form des Proteins (92 Aminosäuren, 10,2 kDa) besteht aus zwei EF-Hand-Helix-Loop-Helix-Strukturen, die durch einen flexiblen Linker verbunden sind. Die C-Klemme EF-Hand enthält das klassische Ca2+-Bindungsmotiv, während die N-TerminalEF-Hand eine S100-proteinspezifische erweiterte Schleifenstruktur (‘pseudo-EF-hand’) aufweist und eine reduzierte Ca2+-Affinitätaufweist. Ca2+-Bindung durch S100A12 kann eine wesentliche konforme Veränderung des C-Terminusder Proteine induzieren, was zu einer Exposition eines hydrophoben Pflasters auf jedem Monomer führt und die Dimerisierungsschnittstelle bildet. So ist die kleinste quaternäre Struktur, die durch S100A12 gebildet wird, unter physiologischen Bedingungen ein nicht-kovalenter Dimer (ca. 21 kDa), in dem einzelne Monomere antiparallel ausgerichtet sind. Als Dimer angeordnet, wird S100A12 als Sequestrierung Zn2+ sowie andere divalente Metallionen, z.B. Cu2+ mit hoher Affinität7gemeldet. Diese Ionen werden an der Dimerschnittstelle S100A12 durch die Aminosäuren H15 und D25 einer Untereinheit und H85 sowie H89 der parallel enzierenden anderen Untereinheit8,9,10koordiniert. Während frühere Studien nahelegten, dass Zn2+-geladene S100A12 die Organisation des Proteins in Homo-Tetramere (44 kDa) induzieren und zu einer erhöhten Ca2+-Affinität11,12führen kann, Studien6 schlagen Ca2+-bindung durch S100A12 vor, um die Affinität des Proteins zu Zn2+zu erhöhen. Sobald die S100A12 EF-Zeiger von Ca2+voll belegt sind, wird angenommen, dass zusätzliche Ca2+ zwischen Dimeren binden und die Hexamerbildung auslösen (ca. 63 kDa). Die Architektur der hexamerischen Viertelstruktur unterscheidet sich deutlich von der des Tetramers. Es wird vorgeschlagen, dass die Tetramer-Schnittstelle unterbrochen wird, um neue Dimer-Dimer-Schnittstellen hervorzurufen, die der Hexamer-Bildung10zugute kommen. S100A12 wird fast ausschließlich von menschlichen Granulozyten ausgedrückt, wo es etwa 5% des gesamten zytosolischen Proteins13ausmacht. In seiner DAMP-Funktion wurde S100A12 historisch als Agonist des Multiligandenrezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) beschrieben, das damals als extrazelluläres neu identifiziertes RAGE-bindendes Protein (EN-RAGE)14bezeichnet wurde. Obwohl wir früher über biochemische S100A12-Bindung sowohl an RAGE als auch an TLR415berichtet haben, haben wir kürzlich gezeigt, dass menschliche Monozyten auf S100A12-Stimulation in einer TLR4-abhängigen Weise reagieren16. Dies erfordert die Anordnung von S100A12 in seine Ca2+/Zn2+-induzierte hexamerische Viertelstruktur16.
Hier beschreiben wir ein Reinigungsverfahren für rekombinantes menschliches S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für Immunzellstimulationen16,17. Diese basiert auf einer zweistufigen Chromatographie-Strategie, die zunächst eine Anionenaustauschsäule umfasst, um das Protein zu isolieren und zu konzentrieren und Massenkontaminationen (z.B. Endotoxine/Lipopolysaccharide) zu entfernen18. Ionenaustauscher-Chromatographieharze trennen Proteine auf der Grundlage unterschiedlicher Netzoberflächenladungen. Bei sauren Proteinen wie S100A12 (isoelektrischer Punkt von 5,81) führt ein Puffersystem mit einem pH-Wert von 8,5 und einem starken Anionenaustauschharz zu einer guten Trennung. Gebundene Proteine wurden mit einem hohen Salzpuffergradienten eluiert. Mit einer Erhöhung der Ionenstärke konkurrieren negative Ionen im Elutionspuffer mit Proteinen um Ladungen auf der Oberfläche des Harzes. Proteine, die je nach Nettoladung einzeln elutieren, und dadurch ermöglichen die hier beschriebenen Puffer, das überexprimierte S100A12-Protein zu isolieren und zu konzentrieren. Aufgrund negativ geladener Gruppen in Lipopolysacchariden binden diese Moleküle auch an Anionenaustauschharze. Ihre höhere Nettoladung führt jedoch zu einer späteren Elution im aufgebrachten Hochsalzgradienten. Der zweite Schritt des Reinigungsverfahrens wurde zu Polierzwecken eingeführt. Dies nutzt die Calciumbindungsfähigkeit von S100A12 und entfernt restliche Verunreinigungen an einer hydrophoben Wechselwirkungssäule. Die Calciumbindung von S100A12 führt zu einer Konformationsänderung und einer Exposition hydrophober Flecken auf der Oberfläche des Proteins. Unter diesem Zustand interagiert S100A12 mit der hydrophoben Oberfläche des Harzes. Bei der Calcium-Chelatierung durch EDTA wird diese Wechselwirkung umgekehrt. In Gegenwart von Ionen, insbesondere Kalzium und Zink, ordnet S100A12 zu homomeren Oligomeren. Um Struktur-Funktions-Beziehungen der verschiedenen Oligomere zu untersuchen, stabilisierten wir dimer, tetramerische und hexamerische Rekombinante S100A12 mit einem chemischen Verklinker und trennten die Komplexe auf einer Farbtonographiesäule mit Größenausschluss. Um die Funktionalität und biologische Aktivität des gereinigten Proteins und seiner ioneninduzierten Oligomere zu analysieren, kann schließlich die Zytokinfreisetzung von S100A12 und LPS stimulierter Monozyten verglichen werden.
Verschiedene Methoden zur Reinigung von S100A12 wurden bisher beschrieben. Jackson et al.19veröffentlichten beispielsweise ein Protokoll mit Reinigung über eine Anionenaustauschsäule und eine anschließende Größenausschlusschromatographie. Das Feinpolieren an einer Größenausschlusssäule führt zu guten Ergebnissen, ist aber aufgrund der z. B. begrenzten Ladevolumina weniger flexibel in der Skalierbarkeit. Ein anderer Ansatz, veröffentlicht von Kiss et al.20, beschreibt die Reinigung des markierten Proteins über Ni2+ Affinitätsspalte als ersten Reinigungsschritt, gefolgt von enzymatischer Spaltung, um das Tag zu entfernen und weitere Reinigungsschritte. Im Gegensatz zu den vorherzitierten Studien19,20wird das in diesem Protokoll beschriebene produzierte Protein für Experimente an Immunzellen bestimmt. Daher ist eine Rest-Endotoxin-Kontamination aus der Bakterienkultur eine Herausforderung. Obwohl bisher unterschiedliche Ansätze zur Endotoxinentfernung beschrieben wurden, gibt es keine einheitliche Methode, die für eine gegebene Proteinlösung gleich gut funktioniert21,22.
Zusammenfassend kombiniert unser Protokoll die Vorteile einer tagfreien Expression in einem bakteriellen System mit einer effizienten Endotoxinentfernung und einer hohen Ausbeute an reinem Protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die tagfreie bakterielle Expression des menschlichen S100A12 und seine Reinigung sowie die Trennung in verschiedene Ionen-induzierte Oligomere zur Immunzellstimulation. Im Vergleich zur veröffentlichten Literatur zur S100A12-Proteinreinigung8,23,24ist die Verwendung von hohem CaCl2 (25 mM) in der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unseres Wissens einzigartig. Mehrere Protok…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Stipendien des intramuralen innovativen medizinischen Forschungsprogramms der Medizinischen Fakultät der Universität Münster (KE121201 bis C.K.) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Fo354/3-1 bis D.F.)unterstützt.
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
Referenzen
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