Dieses Protokoll beschreibt eine Reinigungsmethode für rekombinantes tagfreies Calciumbindungsprotein S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für humane Monozytenstimulationstests.
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Methodenartikel
Reinigung des menschlichen S100A12 und seiner Ionen-induzierten Oligomere zur Immunzellstimulation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Reinigung des humanen Calcium-bindenden Proteins S100A12 und seiner ioneninduzierten Oligomere aus der Escherichia coli-Kultur für Immunzellstimulationen. Dieses Protokoll basiert auf einer zweistufigen Chromatographiestrategie, die die Proteinvorreinigung auf einer Anionenaustauschchromatographiesäule und einen anschließenden Polierschritt auf einer hydrophoben Wechselwirkungssäule umfasst. Diese Strategie produziert S100A12 Protein von hoher Reinheit und Ausbeute zu überschaubaren Kosten. Für funktionelle Tests an Immunzellen erfordert eine eventuelle Rest-Endotoxin-Kontamination eine sorgfältige Überwachung und weitere Reinigungsschritte, um endotoxinfreies Protein zu erhalten. Die mehralsige Endotoxinkontamination kann durch Anionenaustauschchromatographie ausgeschlossen werden. Um Restkontaminationen zu beseitigen, beschreibt dieses Protokoll einen Entfernungsschritt mit Zentrifugalfiltern. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12 in verschiedene Homomultimere anordnen. Um das Verhältnis zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, beschreibt dieses Protokoll die Ionenbehandlung von S100A12-Protein enden, gefolgt von chemischer Vernetzung zur Stabilisierung von S100A12-Oligomeren und deren anschließender Trennung durch Größenausschluss. Chromatographie. Schließlich beschreiben wir einen zellbasierten Assay, der die biologische Aktivität des gereinigten Proteins bestätigt und die LPS-freie Zubereitung bestätigt.
Einleitung
S100A12 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das überwiegend von menschlichen Granulozyten produziert wird. Das Protein wird während (systemischer) Entzündungen überexprimiert und sein Serumspiegel, insbesondere bei (auto)entzündlichen Erkrankungen wie systemischer juveniler idiopathischer Arthritis (sJIA), familiärem Mittelmeerfieber (FMF) oder Kawasaki-Krankheit (KD) Krankheitsaktivität und Reaktion auf die Therapie. Abhängig von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie gebührenähnlichen Rezeptoren (TLRs) kann das angeborene Immunsystem durch pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) wie Lipopolysaccharide (LPS) oder Schäden an assoziierten molekularen Mustern (DAMPs....
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Protokoll
HINWEIS: Zur Vorbereitung von Puffern und Lagerlösungen finden Sie in der Zusatztabelle 1.
1. Proteinexpression in E. coli
-
Klonen
- Klonen Sie tagfreie menschliche S100A12 (NCBI-Referenzsequenz: NP_005612.1) in bakteriellen Expressionsvektor pET11b. Um das Protein auszudrücken, wandeln Sie das Konstrukt in E. coli BL21(DE3) um.
-
kultur
- Bereiten Sie eine Starterkultur vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml Wachstumsmedium (LB-Brühe mit 100 g/ml Ampicillin) in einem 14 ml Rundbodenrohr impfen. Über Na....
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Ergebnisse
Nach vorerierierweiser AIEX-Säule (Abbildung 1A-C) und anschließender kalziumabhängiger HIC (Abbildung 2A,B) wurde hochreines Protein gewonnen (Abbildung 2C). Darüber hinaus ergaben Messungen von Endotoxin eine erfolgreiche LPS-Entfernung. Der LPS-Gehalt nach AIEX wurde in einer Verdünnung von 1:10 über dem Assay-Nachweisgrenzwert, d. h. über 500 EU/ml, gemessen. Nach der ersten Filtration durch ein.......
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Diskussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die tagfreie bakterielle Expression des menschlichen S100A12 und seine Reinigung sowie die Trennung in verschiedene Ionen-induzierte Oligomere zur Immunzellstimulation. Im Vergleich zur veröffentlichten Literatur zur S100A12-Proteinreinigung8,23,24ist die Verwendung von hohem CaCl2 (25 mM) in der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unseres Wissens einzigartig. Mehrere Protoko.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Stipendien des intramuralen innovativen medizinischen Forschungsprogramms der Medizinischen Fakultät der Universität Münster (KE121201 bis C.K.) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Fo354/3-1 bis D.F.)unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| pET11b Vektor | Novagen | ||
| BL21(DE3) kompetent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Nicht-essentielle Aminosäuren | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4− 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gele | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin Natriumsalz | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (Bis(sulfosuccinimid)suberat) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Entfärbungslösung | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Färbelösung | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Humanes Monozytenanreicherungskit | Stammzelle | 19059 | Isoliertes Kit für magnetische negative Zellen |
| EDTA Dinatriumsalzdihydrat | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin-Nachweis Assay |
| Endotoxinfreies Reinstwasser | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Reinstwasser zur Herstellung von endotoxinfreien Puffern |
| EndoTrap rot | Hyglos | 321063 | Endotoxinentfernungsharz |
| FBS (hitzeinaktiviert) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (hohe Qualität, Endotoxin getestet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharide aus E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Trennlösung (Dichtegradientenzentrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenylsepharose Hochleistungs-GE | Healthcare | 17-1082-01 | Harz für hydrophobe Interaktionschromatographie |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Proteasehemmer Tabletten | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Harz für die Anionenaustauschchromatographie |
| RoboSep Puffer | Stemcell | 20104 | Zelltrennungspuffer (Abschnitt 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Natriumhydroxid | Carl Roth | P031.1 | |
| Trisbase | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinkchlorid | Carl Roth | T887< | |
| strong>Labware | |||
| 0,45 &Mikro; m Spritzenfilter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL Rundbodenröhrchen | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer Kolben | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 Well Suspensionsplatten | Greiner | 662102 | |
| 5 L Messbecher | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL konische Zentrifugenröhrchen | Corning | 430829 | |
| 50 mL Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Kulturschale (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Verschlüsse für Dialyseschläuche | Spektrum | 132738 | |
| EasySep Magnet 'The Big Easy'Stammzelle | 18001 | ||
| Fraktionssammlerröhrchen 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox Film, 25 & micro; m, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Folie für Monozyten-Kulturplatten |
| Spectra/Por Dialysemembran (3,5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop Filtereinheit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 ° C Inkubator (mit Schütteln) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| Ä KTA Reiniger UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraktionssammler | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Zentrifuge (mit Rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Festwinkelrotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell BioRad | 1658000EDU | ||
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluoreszenz-Reader | Tecan | unendlich M200PRO pH-Messgerät | |
| Knick | 765 |
Referenzen
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phago....
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Nachdrucke und Genehmigungen
