免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製
Summary
このプロトコルは、組換えタグフリーカルシウム結合タンパク質S100A12およびヒト単球刺激アッセイのためのイオン誘導オリゴマーの精製方法を説明する。
Abstract
本プロトコルでは、ヒトカルシウム結合タンパク質S100A12及びそのイオン誘発オリゴマーを免疫細胞刺激のための大腸菌培養から精製する方法について述べた。このプロトコルは、アニオン交換クロマトグラフィーカラム上のタンパク質事前精製および疎水性相互作用カラム上のその後の研磨工程を含む2段階のクロマトグラフィー戦略に基づいています。この戦略は、高純度のS100A12タンパク質を生成し、管理可能なコストで収量します。免疫細胞の機能的アッセイの場合、最終的に残りのエンドトキシン汚染は、エンドトキシンフリータンパク質を得るために慎重な監視とさらなる洗浄ステップを必要とします。エンドトキシン汚染の大部分は、アニオン交換クロマトグラフィーによって除外することができます。残留汚染を枯渇させるために、このプロトコルは遠心フィルターによる除去ステップを記述する。利用可能なイオン強度S100A12に応じて、異なるホモマルチマーに配置することができます。構造と機能の関係を調べるために、このプロトコルはさらにS100A12タンパク質のイオン処理について説明し、続いて化学架橋でS100A12オリゴマーを安定化させ、その後のサイズ排除による分離を行う。クロマトグラフィー。最後に、精製タンパク質の生物活性を確認し、LPSフリー製剤を確認する細胞ベースのアッセイについて説明します。
Introduction
S100A12は、主にヒト顆粒球によって産生されるカルシウム結合タンパク質である。タンパク質は(全身性)炎症およびその血清レベルの間に過剰発現され、特に全身性若年性特発性関節炎(sJIA)、家族性地中海熱(FMF)または川崎病(KD)などの(自動)炎症性疾患において、疾患活動と治療への反応。トール様受容体(TCR)などのパターン認識受容体(PRR)に応じて、自然免疫系は、リポ多糖類(LPS)のような病原体関連分子パターン(AmpP)または損傷関連分子パターン(AmpP;「アラームイン」とも呼ばれます)。DamPは、細胞タンパク質、脂質または核酸1などの内因性分子である。DAMP機能は、カルグラヌリンタンパク質ファミリーのメンバー、S100A8/A9およびS100A122のメンバーについてよく記載されており、これはまた、解数金属イオンキレート系抗菌ペプチド3、4、として動作することが報告されています。5,6.利用可能なイオン強度S100A12は、S100ファミリーの他のメンバーと同様に、異なるホモマルチマーに配置し、最近までPrR相互作用、特にTLR4に対するS100A12オリゴマーライゼーションの影響は不明であった。
タンパク質の単量体形態(92アミノ酸、10.2 kDa)は、柔軟なリンカーによって接続された2つのEFハンドらせんループ-らせん構造から構成されています。C末端EFハンドは古典的なCa2+-結合モチーフを含み、N-末端EF-handはS100タンパク質特異的拡張ループ構造(「擬似EF-hand」)を示し、Ca2+-親和性の低下を明らかにする。S100A12によるCa2+結合は、タンパク質のC-終端の大きな立体構造変化を誘発し、各モノマー上の疎水性パッチの曝露を引き起こし、ダイメナライゼーション界面を形成する。したがって、生理学的条件下では、S100A12によって形成される最小の四分円構造は、個々のモノマーが反平行方向にある非共有ダイマー(約21 kDa)である。ダイマーとして配置された場合、S100A12は、Zn2+ならびに他の二価金属イオン、例えば、高い親和性7を持つCu2+を隔離すると報告される。これらのイオンは、1つのサブユニットおよびH85のアミノ酸H15およびD25、ならびに反並列他のサブユニット8、9、10のH89によってS100A12ダイマー界面で調整される。以前の研究では、Zn2+-loaded S100A12がタンパク質の組織をホモテトラマー(44 kDa)に誘導し、Ca2+-親和性11、12、最近の金属滴定を増加させる可能性があることを提案しています。研究6は、Zn 2+に対するタンパク質の親和性を高めるためにS100A12によるCa2+-結合を示唆している。S100A12 EF-handsがCa2+によって完全に占有されると、追加のCa2+はダイマー間で結合すると考えられ、ヘキサ形成(約63 kDa)をトリガする。ヘメザリック四半期構造のアーキテクチャは、テトラマーの構造とは明らかに異なります。テトラマーインターフェイスは、ヘキサー形成10に利益をもたらす新しいダイマーダイマーインターフェイスを生み出すために破壊することが提案されています。S100A12は、全ての細胞質タンパク質13の約5%を構成するヒト顆粒球によってほぼ排他的に発現される。そのDAMP機能S100A12では、歴史的に高度な糖化最終産物(RAGE)に対するマルチリガンド受容体のアゴニストとして記述され、次いで細胞外同定されたRAGE結合タンパク質(EN-RAGE)14と呼ばれる。我々は以前にRAGEとTLR415の両方に生化学的S100A12結合を報告したが、我々は最近、TLR4依存的な方法16でS100A12刺激に応答するヒト単球を実証した。これには、Ca2+/Zn2+-誘発されたヘメザリック四半期構造 16 に S100A12 を配置する必要があります。
ここでは、組換えヒトS100A12およびその免疫細胞刺激のためのイオン誘発オリゴマーの精製手順を説明する 16,17.これは、最初にタンパク質を単離して濃縮し、バルク汚染(例えば、エンドトキシン/リポ多糖類)18を除去するアニオン交換カラムを含む2段階のクロマトグラフィー戦略に基づいています。イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、異なる正味表面電荷に基づいてタンパク質を分離します。S100A12(等電点5.81)のような酸性タンパク質の場合、pHが8.5と強いアニオン交換樹脂を持つ緩衝系が良好な分離につながります。結合タンパク質を高塩バッファー勾配でタンパク質でタンパク質化した。溶出バッファー内のイオン強度マイナスイオンの増加に伴い、樹脂表面の荷当量に対するタンパク質と競合する。タンパク質は、その正味電荷に応じて個別に溶出し、その結果、ここに記載される緩衝液は、過剰発現したS100A12タンパク質を単離および濃縮することを可能にする。リポ多糖類の負の荷電基のために、これらの分子はまた、アニオン交換樹脂に結合します。しかし、その正味電荷は、適用された高塩勾配で後で溶出します。精製手順の第2段階は、研磨のために導入されている。これはS100A12のカルシウム結合能を利用し、疎水性相互作用カラム上の残りの不純物を除去する。S100A12のカルシウム結合は、タンパク質の表面に立体構造変化および疎水性パッチの曝露につながる。その条件下で、S100A12は樹脂の疎水性表面と相互作用する。EDTAによるカルシウムキレートでは、この相互作用が逆転する。イオン、特にカルシウムおよび亜鉛の存在下で、S100A12はホモメリックオリゴマーに配置する。異なるオリゴマーの構造機能関係を研究するために、化学架リンカーでダイメリック、四面体およびヘメダリック組換えS100A12を安定化させ、サイズ排除クロマトグラフィーカラム上の複合体を分離した。最後に、精製タンパク質とそのイオン誘発オリゴマーの機能性および生物学的活性を分析するために、S100A12およびLPS刺激単球のサイトカイン放出を比較することができる。
S100A12を精製するための種々の方法は、これまでに説明されている。Jackson et al.19は、例えば、アニオン交換カラムおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製したプロトコルを公開した。サイズ除外列の精製研磨は良好な結果につながりますが、例えば荷重量が限られているため、スケーラビリティの柔軟性が低くなります。Kiss et al.20によって公開された別のアプローチは、最初の精製ステップとしてNi2+アフィニティカラムを介してタグ付けされたタンパク質の精製を記述し、続いてタグを除去し、さらに精製ステップを酵素切断する。前述の研究19、20とは対照的に、このプロトコルに記載されているように産生されたタンパク質は、免疫細胞上の実験のために決定される。従って、細菌培養物からの残存エンドトキシン汚染が課題である。エンドトキシン除去のための異なるアプローチはこれまで説明されているが、任意の与えられたタンパク質溶液21、22に対して同等に機能する均一な方法はない。
要約すると、我々のプロトコルは、効率的なエンドトキシン除去と純粋なタンパク質の高収率と細菌系におけるタグフリー発現の利点を兼ね備えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、ヒトS100A12のタグフリー細菌発現およびその精製、ならびに免疫細胞刺激のための異なるイオン誘発オリゴマーへの分離について説明する。S100A12タンパク質精製8、23、24に関する文献と比較して、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける高CaCl2(25mM)の使用は我々の知識に特有である。1から…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ミュンスター大学医学部(KE121201からC.K.)とドイツ研究財団(DFG、Fo354/3-1からD.F.)の内壁内革新的な医学研究プログラムからの助成金によって支援されました。
Materials
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100 x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) – 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha – OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
Referenzen
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