Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.
Abstract
Die Definition des idealen Modells für eine In-vitro-Studie ist vor allem bei der Untersuchung physiologischer Prozesse wie der Zelldifferenzierung von entscheidender Bedeutung. Im Tumor stroma werden Wirtsfibroblasten von Krebszellen zur Differenzierung angeregt. So erwerben sie einen Phänotyp, der zur Tumormikroumgebung beiträgt und die Tumorprogression unterstützt. Mit Hilfe des Sphäroidmodells haben wir ein solches 3D-In-vitro-Modellsystem eingerichtet, in dem wir die Rolle von Laminin-332 und dessen Rezeptorintegrin 3-1 in diesem Differenzierungsprozess analysiert haben. Dieses Sphäroid-Modellsystem reproduziert nicht nur die Tumor-Mikroumgebungsbedingungen genauer, sondern ist auch ein sehr vielseitiges Modell, da es verschiedene nachgelagerte Studien ermöglicht, wie z. B. immunfluoreszierende Färbung ender intra- und extrazellulärer Marker sowie abgelagerte extrazelluläre Matrixproteine. Darüber hinaus können Transkriptionsanalysen durch qPCR, Durchflusszytometrie und zelluläre Invasion mit diesem Modell untersucht werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll eines Sphäroidmodells zur Bewertung der Rolle des INtegrins von CAFs und seines ektopisch abgelagerten Ligands Laminin-332 bei der Differenzierung und bei der Unterstützung der Invasion von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen.
Introduction
Die Tumormikroumgebung ist eine sehr komplexe Nische und extrem wichtig für die Erhaltung und Progression der Tumorzellen1. Es wird nicht nur von den Krebszellen, sondern auch von stromalen Fibroblasten gebildet. Die Tumorzellen sind von einem Stroma umgeben, der spezifisch ist und sich von den Stroma normaler Gewebe2unterscheidet. Laminin-332 ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das ektopisch im Stroma verschiedener Tumoren, wie z.B. des Pankreas-Adenokarzinoms3, exprimiert wird. Darüber hinaus verändern sich die biochemische Zusammensetzung des ECM und seine biophysikalischen Eigenschaften, wie Steifigkeit und Spannung, innerhalb der Tumormasse4. Dieser Tumor stroma, oder “reaktive se”, wird durch eine Anpassung von Fibroblasten an die benachbarten Krebszellen und durch die Rekrutierung anderer sehr wichtiger Akteure verursacht, die ein günstiges und unterstützendes Umfeld für die Tumorprogression entwickeln. Die Differenzierung von stromalen Fibroblasten führt zu krebsassoziierten Fibroblasten (CAF). Diese Zellen können mit verschiedenen Markern identifiziert werden, wie z.B. mit dem glatten Muskelaktin (SMA)5 oder dem neuronalen/glialen Antigen 2 (NG2)6.
Das am besten geeignete In-vitro-Modell, um die Tumormikroumgebung (TME) mit CAFs zu rekapitulieren, ist schwer zu wählen. Die Methode, physiologische Parameter der TME kosteneffizient und reproduzierbar nachzuahmen, muss für ein solches Modellsystem in Betracht gezogen werden. Innerhalb der TME treten verschiedene Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Migration und Invasion der verschiedenen Zelltypen auf. Diese zellulären Prozesse können individuell mit unterschiedlichen Methoden durchgeführt werden. Die experimentellen Bedingungen müssen jedoch die zellulären Wechselwirkungen mit dem Tumor stroma ECM berücksichtigen, da die Steifigkeit des Substrats den CAF-Differenzierungsprozess beeinflusst. R.G. Wells kommentierte die Auswirkungen der Matrixsteifigkeit auf das Zellverhalten und betonte, dass die zytoskelettale Organisation und der Differenzierungsstatus, die in in vitro kultivierten Zellen beobachtet wurden, artefactual sein könnten7. Verschiedene Reize scheinen an der CAF-Differenzierung beteiligt zu sein, einschließlich mechanischer Spannung5,7. Um dies zu vermeiden, könnten 2D-weiche Substrate mögliche Ansätze für Differenzierungsstudien sein, da sie das Problem der steifen Kulturschale Kunststoff umgehen. Eine weiche 2D-Oberfläche, auf der Fibroblasten angebaut werden können, können kollagen-I-beschichtete Polyacrylamidgele sein, wobei die Gelsteifigkeit durch die Konzentration von Polyacrylamid und dem Gel-Verlinker manipuliert werden kann. Die Haftung und Bildung von SMA-reichen Spannungsfasern wird in Fibroblasten zusammen mit der Gelsteifigkeit8verstärkt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung weicher Substratgerüste für physiologischere In-vitro-Differenzierungsmodelle. In unseren Händen waren jedoch die experimentelle Reproduzierbarkeit und Bildgebung dieser Gele eine Herausforderung. Um diese Mängel zu überwinden, haben wir das 2D-Softsubstratsystem für ein 3D-Sphäroidmodell für Differenzierungs- und Invasionsstudien geändert. Dieses Modell ist klinisch relevanter und rekapituliert, ähnlich wie ein In-vitro-Organoid, in vivo Zell-Zell-Wechselwirkungen, ECM-Produktion und -Deposition sowie Zellverhalten9.
Sphäroide entstehen, wenn zellenein Substrat fehlt, an dem sie haften können. Wenn die Zellen ohne Klebefläche verlassen werden, aggregieren sie sich zu einer mehr oder weniger kugelförmigen Struktur. Wenn die Sphäroide aus einem Zelltyp bestehen, werden sie Homosphäroide genannt; wenn sie aus zwei oder mehr verschiedenen Zelltypen bestehen, bilden sie Heterosphäride.
Unter den verschiedenen Methoden für die Sphäroid-Vorbereitung führen wir das Protokoll mit nicht haftenden runden 96-Well-Platten durch. Es ist sehr effektiv in Bezug auf die Kosten. Hier produzieren wir sowohl Homosphäoide von Fibroblasten, CAF oder CAFs ohne die Untereinheit integrin 3, um den Differenzierungsprozess und die Heterosphäroide von CAFs oder Integrin-KO-CAFs und Pankreaskanalkarzinomzellen (AsPC-I und PANC-I) zu untersuchen, um die Invasion zu untersuchen. in die umgebende Matrix.
Ziel dieser Studien war die Verwendung primärer CAFs, die aus biopsien humanen Pankreaskarzinomen isoliert wurden. Die Biopsien zur Gewinnung der Zellen sind jedoch knapp, und aus diesem Grund wurden die in diesen Studien verwendeten CAFs mit dem Lentivirus, das HTERT enthält, verewigt. Sie werden iCAFs genannt, und ihre normalen Gegenstücke, primäre menschliche Pankreas-Fibroblasten, werden als iNFs bezeichnet. Die menschlichen Pankreas-Fibroblasten und die Pankreaskanal-Karzinomzellen AsPC-I und PANC-I sind im Handel erhältlich.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Laminin-332-Integrin-Wechselwirkung im CAF-Differenzierungsprozess zu untersuchen. Um die Spezifität dieser Wechselwirkung und ihrer Funktion zu beweisen, wurden Inhibitorverbindungen verwendet: BM2, ein monoklonaler Antikörper, der die Integrin-Bindungsstelle die Laminin-332-Kette10oder Lebein 1 blockiert, eine von Schlangengift abgeleitete Verbindung, die die Laminin-Bindungs-Integrine , 3, 1, 11,12, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
Für den Invasionstest wurden Zellen mit Lentivirus transduziert, die cDNA-Codierung entweder mCherry (iCAFs und Integrin 3 KO iCAFs) oder GFP (AsPC-I und PANC-I) enthielten, um die verschiedenen Zelltypen in den Heterosphäroiden zu unterscheiden. Die Transduktion der Zellen, um sie zu verewigen und/oder sie mit fluoreszierender Proteinexpression (mCherry und GFP) zu kennzeichnen, wird in einer früheren Studie13beschrieben, die für weitere Informationen konsultiert werden sollte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung eines geeigneten In-vitro-Modells zur Untersuchung der CAF-Differenzierung ist eine schwierige Aufgabe. Nach der Anwendung verschiedener Ansätze kamen wir zu dem Schluss, dass ein 3D-Sphäroidmodell das praktischere, physiologischere und klinisch relevantere Modell ist, bei dem das Zusammenspiel von Pankreaskarzinomzellen mit verewigten CAFs untersucht werden kann. Dieses Modell verhinderte eine spontane Differenzierung von Fibroblasten aufgrund artefakter Stressoren wie Steifigkeit des Zellkulturkunstst…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen Barbara Scheddings Hilfe bei der Vorbereitung des BM2 und lebein-1. Wir würdigen, dass er ihre Expertise in Sphäroid-Assays geteilt hat. Wir danken Sonja Schelhaas und Michael Schäfers für ihre Hilfe beim Umgang mit lentiviraler Transfektion unter S2-Bedingungen. Wir würdigen Sabine von Rüdens Unterstützung bei der Vorbereitung von CAFs aus Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe.
Die Zu diesem Ergebnis führten Forschungsarbeiten wurden aus dem People-Programm (Marie-Curie-Maßnahmen) des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union RP7/2007-2013/ im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung n. (316610) an J.A.E. finanziert. Darüber hinaus wurden J.A.E. und A.C.M.C. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Exzellenzclusters Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM) finanziell unterstützt. Dieses Projekt wurde auch von der Wilhelm Sander Stiftung unterstützt (Zuschuss: 2016.113.1 an J.A.E.).
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
Referenzen
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