3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.
Abstract
הגדרת המודל האידיאלי למחקר בתחום החוץ היא חיונית, בעיקר אם לומדים תהליכים פיזיולוגיים כגון הבחנה של תאים. ב הגידול משתית, מארח פיברותקיעות מגורה על ידי תאים סרטניים כדי להבדיל. כך, הם רוכשים פנוטיפ שתורם לסביבת הגידול מיקרו ותומך התקדמות הגידול. באמצעות מודל ספרואיד, יש לנו להגדיר כזה 3D במערכת מודל מבחנה, שבו ניתחנו את התפקיד של למינציה-332 ואת הקולטן שלה אינטגרציה α3β1 בתהליך זה בידול. זו מערכת מודל ספרואיד לא רק מתרבה את התנאים מיקרוסביבה הגידול באופן מדויק יותר, אבל גם הוא מודל תכליתי מאוד מאז הוא מאפשר מחקרים שונים במורד הזרם, כגון immunofluorescent כתמים של שני פנים ומסחטות סמנים, כמו גם הופקד מטריקס חלבונים מטריצות. יתר על כן, ניתוח ההמרה על ידי qPCR, הזרימה cy, לנסות הפלישה התאית ניתן ללמוד עם המודל הזה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול של מודל ספרואיד כדי להעריך את התפקיד של CAFs ‘ אינטגרin α3β1 ו שלה הופקד למריחה, למינציה ב-332, בידול ותמיכה בפלישה של תאים סרטניים בלבלב.
Introduction
מיקרוסביבה הגידול הוא נישה מורכבת מאוד חשוב מאוד עבור תחזוקה והתקדמות של תאים סרטניים1. הוא נוצר לא רק על ידי התאים הסרטניים אלא גם על ידי סטרומה פיברופיצוצים. התאים הסרטניים מוקפים משתית כי הוא ספציפי ושונה מסטרומה של רקמות נורמלי2. למינציה-332 הוא חלבון מטריצות מטריתאי המתבטאת בסטרומה של גידולים שונים, כגון הלבלב אדנוקרצינומה3. יתר על כן, ההרכב הביוכימי של ECM וגם המאפיינים הביופיסיים שלה, כגון קשיחות ומתח, שינוי בתוך הגידול בצובר4. זה הגידול משתית, או “משתית תגובתי”, נגרמת על ידי עיבוד של פיברותקיעות לתאים סרטניים השכנה ועל ידי גיוס של שחקנים חשובים מאוד אחרים המפתחים סביבה חיובית ותומכת עבור התקדמות הגידול. הבידול של סטרומה התוצאות התרופות הקשורות לסרטן (בקפה). תאים אלה יכולים להיות מזוהים באמצעות סמנים שונים כגון α-שריר החלקה אקטין (αSMA)5 או עצביים/גליאל אנטיגן 2 (NG2)6.
המתאים ביותר במודל החוץ גופית כדי ללכוד את מיקרואת הסביבה הגידול (tme) עם cafs קשה לבחור. השיטה לחקות את הפרמטרים הפיזיולוגיים של TME בדרך חסכונית וניתנים לקריאה חייב להיחשב עבור מערכת מודל כזו. בתוך TME, תהליכים שונים, כגון התפשטות, בידול, הגירה ופלישה של סוגי תאים שונים מתרחשים. ניתן לבצע תהליכים סלולריים אלה באופן אינדיבידואלי עם שיטות שונות. עם זאת, התנאים הניסיוניים חייבים לשקול את האינטראקציות הסלולריות עם הגידול משתית ECM, מאז הנוקשות של הרובד התחתי משפיע על תהליך הבידול. Rg. וולס הגיב על ההשפעה של נוקשות מטריקס על התנהגות התא מודגש כי ארגון השלד הציטוזה הבחין בתאים מחוץ לגוף מתורבת יכול להיות ארטעובדתית7. גירויים שונים נראים מעורבים בבידול קפה, כולל מתח מכני5,7. כדי למנוע זאת, 2D מצעים רכים יכול להיות גישות אפשריות ללימודי בידול, כפי שהם לעקוף את הבעיה של פלסטיק תבשיל התרבות הנוקשה. משטח דו-ממדי רך, שבו ניתן לגדל את הפיברותקיעות, יכול להיות קולגן-אני מצופה ג’ל פוליאקרילמיד, לפיה קשיות ג’ל יכול להיות מניפולציות על ידי ריכוז של פוליאקריל ו ג’ל חוצה-מקשר. הדבקה והיווצרות של סיבי סטרס αSMA-עשיר משופרים בתוך פיברובפיצוצים יחד עם נוקשות ג’ל8. תוצאות אלו מדגישים את החשיבות של המצע הרך פיגומים על מודלים פיזיולוגיים יותר של בידול מתורבת. עם זאת, בידינו את השגות הניסיוני הדמיה של ג’לים אלה היו מאתגרת. כדי להתגבר על החסרונות האלה, שינינו את מערכת המצע הרכה 2D למודל ספרואיד תלת-ממדי לבידול ולימודי פלישה. מודל זה הוא רלוונטי יותר קלינית, ובדומה לאורגנואיד, הvivo באינטראקציות תא תאים, ייצור ECM והתצהיר, כמו גם התנהגות תא9.
Spheroids נוצרות כאשר התאים חסרים מצע לדבוק. כאשר התאים משמאל ללא משטח דביק, הם מצטברים כדי ליצור מבנה כדורי פחות או יותר. אם הספרואידים מורכבים מסוג אחד של תא, הם נקראים הומורואידים; אם מורכב משני סוגי תאים שונים או יותר הם יוצרים הטרוהרואידים.
בין השיטות השונות של הכנה ספרואיד, אנו מבצעים את הפרוטוקול באמצעות התחתונה בסיבוב התחתון שאינם חסיד 96-טוב צלחות. זה מאוד יעיל ביחס לעלויות. כאן, אנו מייצרים גם הומורואידים של פיברובמות, קפה או קפה חסר אינטגרציה α3 יחידת כדי לבחון את תהליך הבידול ואת הטרולאידים של cafs או אינטגרציה α3 KO cafs ואת צינור קרצינומה של הלבלב תאים (aspc-i ו panc-i) כדי ללמוד את הפלישה לתוך המטריקס שמסביב.
המטרה עבור מחקרים אלה היה להשתמש בבתי קפה הראשי מבודדים קרצינומה של סרטן הלבלב האנושי. עם זאת, ביופסיות כדי להשיג את התאים הם נדירים ולכן, הקפה בשימוש במחקרים אלה כבר הונצח באמצעות וירוס המכיל HTERT. הם נקראים iCAFs, ואת עמיתיהם הרגיל שלהם, הראשון הלבלב פיברופיצוצים, נקראים iNFs. בסרטן הלבלב ובתאי קרצינומה של הלבלב, AsPC-I ו-PANC-I, הם מסחרית זמין.
פרוטוקול זה שימש לחקר ההשפעה של האינטראקציה המילמינציה-332-אינטגרציה בתהליך הבידול. כדי להוכיח ספציפיות של האינטראקציה הזאת ואת תפקידה, תרכובות מעכבי שימשו: BM2, נוגדן חד שבטיים שחוסם את האינטגרציה באתר מחייב-332 α3 שרשרת10, או להיות 1, ארס נחש נגזר תרכובת החוסמת את ה אינטגרציה מα3β1 למינציה, α6β1 ו-α7β111,12.
עבור שיטת הפלישה, תאים התעברו התמרה עם וירוס המכיל cDNA קידוד או mCherry (iCAFs ואינטגרציה α3 KO iCAFs) או GFP (AsPC-I ו-PANC-I) כדי להבדיל בין סוגי תאים שונים בהטרומאידים. התמרה של התאים להנציח אותם ו/או לתייג אותם עם חלבון פלורסנט (mCherry ו-GFP) ביטוי מתואר במחקר הקודם13, כי יש להתייעץ לקבלת מידע נוסף.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפתח מודל מתאים מחוץ לחדר העבודה כדי ללמוד בידול בקפה הוא משימה מאתגרת. לאחר שימוש בגישות שונות, הגענו למסקנה כי מודל 3D ספרואיד הוא המודל מעשי יותר, פיסיולוגי וקליני, שבו הגומלין בין תאים קרצינומה של הלבלב עם מונצח CAFs ניתן ללמוד. מודל זה מונע הבחנה ספונטנית של הפיברוטינים, בשל התמחלות ארטעו…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בעזרתו של ברברה שרינג בהכנת הBM2 ולביין -1. אנו מכירים ב-Àgnes נואל, על שיתוף המומחיות שלה בספרואיד. אנו מודים לסוניה שלהאס ולמייקל שלינג לעזרתם בטיפול בזיהום ויראלי בתנאים של S2. אנו מכירים את assistence של סבין פון Rüden’s בהכנת CAFs מרקמת סרטן הלבלב.
המחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתוכנית העם (מארי קירי פעולות) של תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי FP7/2007-2013/תחת הסכם המענק REA n ◦ (316610) כדי J.A.E. יתר על כן, J.A.E. ו A.C.M.C. היה נתמך מבחינה כספית על ידי הגרמני Forsch שבירכתיים (DFG) בתוך אשכול תאים בתנועה של מצוינות (EXC 1003-CiM). פרויקט זה נתמך גם על ידי וילהלם סנדר Stiftung (גרנט: 2016.113.1 to J.A.E.).
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
Referenzen
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?. Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco, ., C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -. C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
