がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル
Summary
このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。
Abstract
インビトロ研究のための理想的なモデルを定義することは、主に細胞の分化などの生理学的プロセスを研究する場合に不可欠です。腫瘍間質では、宿主線維芽細胞は癌細胞によって刺激され分化する。したがって、それらは腫瘍微小環境に寄与し、腫瘍の進行を支持する表現型を獲得する。このスフェロイドモデルを用いて、このような3Dインビトロモデルシステムを設定し、この分化過程におけるラミニン-332とその受容体インテグリンα3β1の役割を解析した。このスフェロイドモデルシステムは、腫瘍微小環境条件をより正確な方法で再現するだけでなく、細胞内および細胞外の免疫蛍光染色などの異なる下流研究を可能にするので、非常に汎用性の高いモデルです。マーカー、ならびに沈着した細胞外マトリックスタンパク質。さらに、qPCRによる転写解析、フローサイトメトリーおよび細胞侵襲は、このモデルで研究することができる。ここでは、CAFのインテグリンα3β1およびその異位堆積リガンド、ラミニン-332の役割を評価するスフェロイドモデルのプロトコルを、分化および膵臓癌細胞の侵入を支持する。
Introduction
腫瘍微小環境は非常に複雑なニッチであり、腫瘍細胞1の維持および進行にとって非常に重要である。これは、癌細胞だけでなく、間質線維芽細胞によっても形成されます。腫瘍細胞は、正常組織2の間質と特異的かつ異なる間質に囲まれている。ラミニン-332は、膵臓腺癌3のような異なる腫瘍の間質で異なる腫瘍の間質で異なる細胞外マトリックスタンパク質を発現する。また、ECMの生化学的組成物および剛性および張力などの生体的性質も、腫瘍バルク4内で変化する。この腫瘍間質、または「反応性間質」は、隣接する癌細胞への線維芽細胞の適応および腫瘍進行のための有利で支持的な環境を開発する他の非常に重要なプレーヤーの募集によって引き起こされる。間質線維芽細胞の分化は癌関連線維芽細胞(CAF)をもたらす。これらの細胞は、α平滑筋アクチン(αSMA)5または神経/グリア抗原2(NG2)6などの異なるマーカーを用いて同定することができる。
腫瘍微小環境(TME)をCAFで要約するのに最も適したインビトロモデルを選択することは困難である。このようなモデルシステムについては、費用対効果が高く再現可能な方法でTMEの生理的パラメータを模倣する方法を考慮する必要があります。TME内では、異なる細胞タイプの増殖、分化、移行、および侵入などの異なるプロセスが発生します。これらの細胞プロセスは、異なる方法で個別に行うことができる。しかし、実験条件は、下層の剛性がCAF分化プロセスに影響を与えるので、腫瘍間質ECMとの細胞相互作用を考慮しなければならない。R.G.ウェルズは、細胞の行動に対するマトリックス剛性の影響についてコメントし、インビトロ培養細胞で観察された細胞骨格組織および分化状態が動脈実7である可能性があることを強調した。機械的緊張5、7を含むCAFの分化に異なる刺激が関与しているようです。これを回避するために、2D軟質基板は、硬い培養皿プラスチックの問題を回避するので、分化研究のためのアプローチが可能である可能性があります。線維芽細胞を成長させることができる柔らかい2D表面は、コラーゲン-Iコーティングポリアクリルアミドゲルであり、それによってゲル剛性は、ポリアクリルアミドおよびゲル架材の濃度によって操作することができる。αSMAリッチストレス繊維の接着および形成は、ゲル剛性8と共に線維芽細胞において増強される。これらの結果は、より多くの生理的なインビトロ分化モデルのための柔らかい基板足場の重要性を強調する。しかし、私たちの手の中では、これらのゲルの実験的再現性とイメージングは困難でした。これらの欠点を克服するために、分化と侵入研究のための3Dスフェロイドモデル用の2Dソフト基板システムを変更しました。このモデルは、より臨床的に関連し、インビトロオルガノイドと同様に、生体内細胞相互作用、ECM産生および沈着、ならびに細胞挙動9における要約を行う。
スフェロイドは、細胞が付着する基板を欠いているときに形成される。細胞が粘着面なしで放置されると、それらは多かれ少なかれ球状構造を形成するために凝集する。スフェロイドが1種類の細胞で構成されている場合、それらはホモスフェロイドと呼ばれています。2つ以上の異なる細胞タイプで構成される場合、それらはヘテロスフェロイドを形成する。
スフェロイド調製のための異なる方法の中で、我々は非付着ラウンドボトム96ウェルプレートを使用してプロトコルを実行します。コストに関しては非常に効果的です。ここでは、線維芽細胞、CAFまたはCAFの両方のホモスペロイドを生成し、CAFまたはインテグリンα3 KO CAFおよび膵管癌細胞(AsPC-IおよびPANC-I)の分化プロセスとヘテロスペロイドを調べるために、インテグリンα3サブユニットを欠いている。周囲のマトリックスに。
これらの研究の目的は、ヒト膵臓癌生検から単離された一次CAFを使用することにあった。しかしながら、細胞を得るための生検は乏しく、このため、これらの研究で使用されるCAFはHTERTを含むレンチウイルスを用いて不死化されている。それらはiCAFと呼ばれ、その正常な対応する原発性ヒト膵臓線維芽細胞はiNFと呼ばれる。ヒト膵線維芽細胞および膵管癌細胞、AsPC-IおよびPANC-Iが市販されている。
このプロトコルは、CAF分化プロセスにおけるラミニン-332-インテグリン相互作用の効果を研究するために使用された。この相互作用およびその機能の特異性を証明するために、阻害剤化合物が用された:BM2、ラミニニン結合部位を遮断するモノクローナル抗体であるラミニニン-332α3鎖10、またはレビン1、またはレビン1、およびスネーク毒由来化合物ラミニン結合インテグリンα3β1、α6β1およびα7β111、12.
侵入アッセイでは、細胞はmCherry(iCAFおよびインテグリンα3 KO iCAF)またはGFP(AsPC-IおよびPANC-I)をコードするcDNAを含むレンチウイルスを用いて、ヘテロスフェロイド中の異なる細胞型を区別するために変換された。それらを不死化し、蛍光タンパク質(mCherryおよびGFP)発現でそれらを標識する細胞の伝達は、以前の研究13で説明されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
CAFの分化を研究するための適切なインビトロモデルを開発することは困難な作業です。異なるアプローチを採用した後、我々は、3Dスフェロイドモデルは、不死化されたCAFを持つ膵癌細胞間の相互作用を研究することができる、より実用的で生理学的および臨床的に関連するモデルであると結論付けた。このモデルは、少なくとも短期的な培養条件(最大48時間)において、細胞培養プラスチッ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、BM2とlebein-1を準備するバーバラ・シェディングの助けを認める。私たちは、スフェロイドアッセイにおける彼女の専門知識を共有するためのアグネス・ノエルを認めます。我々は、S2条件下でレンチウイルストランスフェクションを処理する彼らの助けにソーニャ・シェルハースとマイケル・シェーファーズに感謝します。我々は、膵臓癌組織からCAFを準備するサビーヌ・フォン・リューデンの支援を認める。
これらの結果につながる研究は、欧州連合の第7フレームワークプログラムFP7/2007-2013/REA交付協定n◦(316610)のJ.A.E.に基づき、人民プログラム(マリー・キュリー・アクション)から資金を受け取りました。さらに、J.A.E.とA.C.M.C.は、セル・イン・モーション・クラスター・オブ・エクセレンス(EXC 1003-CiM)内のドイツ・フォルシュチュンゲインシャフト(DFG)によって財政的に支援されました。このプロジェクトは、ヴィルヘルム・サンダー・スティフトゥン(助成金:2016.113.1からJ.A.E.)によっても支援されました。
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
Referenzen
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