从3维球体培养中分离出类似干细胞的细胞
Summary
我们使用人类原发性前列腺上皮细胞，报告一种新的无生物标记方法，通过基于球体的标签保留测定，对干细胞进行功能表征。介绍了 BrdU、CFSE 或远红色 2D 细胞标记的分步协议;三维球形形成;通过免疫细胞化学进行标签保留干细胞鉴定;和隔离由FACS。
Abstract
尽管成人干细胞研究取得了进展，但从组织标本中鉴定和分离干细胞仍然是一个重大挑战。虽然常驻干细胞在成人组织中具有利基约束，但它们进入无锚三维（3D）培养的细胞周期，并经历对称和非对称细胞分裂，产生干细胞和祖细胞细胞。后者迅速增殖，是处于不同谱系承诺阶段的主要细胞群，形成异质球体。使用原发正常的人类前列腺上皮细胞（HPrEC），开发了一种基于球体的标记保留测定，允许在单个细胞分辨率下识别和功能分离球形启动干细胞。
HPrEC 或细胞系与 BrdU 一起培养 10 天，以允许将其纳入所有分裂细胞的 DNA，包括自更新干细胞。洗涤开始转移到3D培养体5天，在此期间，干细胞通过不对称分裂自我更新，并启动球形形成。虽然相对静止的女儿干细胞保留了带有BrdU标记的亲子DNA，但女儿后代迅速增殖，失去了BrdU标签。BrdU可以用CFSE或远红亲染料替代，允许FACS进行活干细胞分离。干细胞特性通过体外球形形成、体内组织再生测定和记录其对称/不对称细胞分裂来确认。下游分子和生物研究，包括RNA-seq、ChIP-seq、单细胞捕获、代谢活性、蛋白酶分析、免疫细胞化学、有机体形成和体内组织再生，可以严格探究分离的标记保留干细胞。重要的是，这种无标记的功能干细胞分离方法从新的癌症标本和来自多个器官的癌细胞系中识别干细胞样，表明其广泛适用性。它可用于识别癌症干细胞样生物标志物，筛选针对癌症干细胞的药物，并发现癌症中新的治疗靶点。
Introduction
人类前列腺含有具有分泌功能的明上皮，其基础细胞以及不寻常的神经内分泌细胞成分。上皮细胞，在这种情况下，产生于罕见的前列腺干细胞群，在体内相对静止，并作为修复系统，以维持腺平衡在整个生命1。尽管取得了许多进展，前列腺干细胞的鉴定和功能分离仍然是该领域的一大挑战。干细胞生物标志物，包括基于细胞表面标记的方法，结合流式细胞测定，通常用于干细胞研究2、3、4。然而，由于标记组合和抗体特异性5，6的函数，富集和分离的结果差异很大，对分离细胞的身份提出了疑问。另一种广泛使用的干细胞富集方法是三维（3D）球体培养2，3，4。虽然常驻干细胞在体内相对静止，具有利基约束，但它们在3D基质培养（对称和非对称）中经历细胞分裂，产生干细胞和祖细胞，迅速繁殖，向血统承诺7，8。形成球体是一种异质混合物，含有干细胞和祖细胞，处于不同谱系承诺阶段，包括早期和晚期祖细胞。因此，使用整个球体的测定不是干细胞独有的，使得独特的干细胞特性的鉴定没有定论。因此，创建检测以识别和分离其女儿后代的前列腺干细胞至关重要。为此，目前协议的目标是建立一个检测系统，以便有效地识别和分离人类前列腺组织的干细胞，然后对其生物功能进行强有力的下游分析。
长期5-溴-2′-脱氧尿碱（BrdU）标签保留被广泛用于体内和体外血统追踪干细胞基于其长期倍增时间9，10。本文描述的前列腺干细胞鉴定和分离的目前方法基于其相对静止特性和在混合上皮种群中的标签保留特性。此外，根据不朽的链DNA假说，只有干细胞可以进行不对称细胞分裂。干细胞代表含有较老父母DNA的子细胞，而祖细胞（即一个承诺子细胞）则接收新合成的DNA。上述独特的干细胞特性被利用在原发培养物的亲子干细胞中执行BrdU标记，然后在转移到3D无锚球体培养物后跟踪其标签。虽然大多数原发性前列腺上皮细胞在二维培养中保留基底和中转扩增表型，但也有罕见的多能干细胞补充和维持上皮平衡，这在转移到3、12时形成球形或完全分化的有机体，具有相应的培养基。在我们目前的协议中，通过使用HPrEC前列腺球体或基于前球的BrdU、CFSE或远红保留性检测，然后进行荧光活化细胞分拣（FACS），我们在单细胞13级识别球体中保留标签的干细胞。
重要的是，我们进一步确认了在早期球体中贴片细胞的干细胞特性，与具有血统承诺的祖细胞相比。这些包括干细胞不对称分裂、体外球体形成能力和体内组织再生能力、自噬活性升高、核糖体生物发生增强和代谢活性下降。随后，进行了RNAeq分析。观察到在标签保留球体细胞中表达的不同基因，这些基因可作为人类前列腺干细胞的新型生物标志物。这种基于球体的标签保留方法可应用于癌症标本，以类似地识别少量癌症干细胞，从而提供转化机会来管理治疗耐药人群13。下面介绍以人类原发性前列腺上皮细胞（HPrEC）为例，采用基于前层的标签保留测定。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用多种干细胞表面标记的流式细胞测定是干细胞研究常用的方法，尽管缺乏特异性和选择性1，5，6。虽然3D培养系统中的球形形成是从原发上皮细胞（包括HPrEC）中丰富稀有干细胞群的另一种有用方法，但产生的球体仍然是茎和祖细胞2、3、4的异质混合物。</su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家癌症研究所R01-CA172220（普惠制，WYH），R01-ES02207（普惠制，WYH）的资助。我们感谢芝加哥伊利诺伊大学的流式细胞学核心在细胞分拣方面给予的帮助。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referenzen
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