Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni
Summary
Utilizzando le cellule epiteliali primarie umane, riportiamo un nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali da un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi. Viene descritto un protocollo passo-passo per l’etichettatura delle celle 2D BrdU, CFSE o Far Red; formazione di sferoidi tridimensionali; l’identificazione delle cellule staminali di conservazione dell’etichetta mediante immunocitochimica; e l’isolamento da parte della FACS.
Abstract
Nonostante i progressi nella ricerca sulle cellule staminali adulte, l’identificazione e l’isolamento delle cellule staminali dai campioni di tessuto rimane una sfida importante. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti con vincoli di nicchia nei tessuti adulti, entrano nel ciclo cellulare in coltura tridimensionale senza ancora (3D) e subiscono sia la divisione cellulare simmetrica che asimmetrica, dando origine sia al gambo che al progenitore Cellule. Questi ultimi proliferano rapidamente e sono la popolazione cellulare principale in varie fasi dell’impegno di lignaggio, formando sferoidi eterogenei. Utilizzando le normali cellule epiteliali della prostata umana primaria (HPrEC), è stato sviluppato un saggio basato su sferoide di ritenzione di etichette che consente l’identificazione e l’isolamento funzionale delle cellule staminali che lo sferoide operino a una risoluzione a singola cellula.
HPrEC o linee cellulari sono bidimensionali (2D) coltivate con BrdU per 10 giorni per consentire la sua incorporazione nel DNA di tutte le cellule che si dividono, comprese le cellule staminali auto-rinnovanti. Wash out inizia al momento del trasferimento alla coltura 3D per 5 giorni, durante i quali le cellule staminali si auto-rinnovano attraverso la divisione asimmetrica e avviano la formazione di sferoidi. Mentre le cellule staminali figlie relativamente quiescenti conservano il DNA parentale etichettato da BrdU, i progenitori della figlia proliferano rapidamente, perdendo l’etichetta BrdU. BrdU può essere sostituito con CFSE o Far Red pro-dyes, che consentono l’isolamento delle cellule staminali vive da FACS. Le caratteristiche delle cellule staminali sono confermate dalla formazione in vitro sferoide, dai saggi di rigenerazione dei tessuti in vivo e dalla documentazione delle loro divisioni cellulari simmetriche/asimmetriche. Le cellule staminali isolate che conservano l’etichetta possono essere rigorosamente interrogate da studi molecolari e biologici a valle, tra cui RNA-seq, ChIP-seq, cattura a singola cellula, attività metabolica, profilazione del proteoma, immunocitochimica, formazione di organiidi e rigenerazione dei tessuti in vivo. È importante sottolineare che questo approccio di isolamento delle cellule staminali funzionali privo di marcatori identifica le cellule staminali provenienti da campioni di cancro freschi e linee cellulari tumorali di più organi, suggerendo un’ampia applicabilità. Può essere usato per identificare biomarcatori cellulari simili a tumori, prodotti farmaceutici di schermata che prendono di mira le cellule staminali tumorali e scoprire nuovi bersagli terapeutici nei tumori.
Introduction
La ghiandola prostatica umana contiene epitelio luminoso con funzione secretoria e cellule basali sottostanti insieme a un insolito componente delle cellule neuroendocrine. Le cellule epiteliali, in questo caso, sono generate da una rara popolazione di cellule staminali prostate che sono relativamente quiescenti in vivo e fungono da sistema di riparazione per mantenere l’omeostasi ghiandolare per tutta la vita1. Nonostante molti progressi, l’identificazione e l’isolamento funzionale delle cellule staminali prostata rimane una sfida importante nel settore. I biomarcatori delle cellule staminali staminali, comprese le metodologie basate su marcatori di superficie cellulare combinate con la citometria di flusso, sono comunemente utilizzati per la ricerca sulle cellule staminali2,3,4. Tuttavia, i risultati per l’arricchimento e l’isolamento variano ampiamente in funzione delle combinazioni di marcatori e della specificità degli anticorpi5,6, sollevando domande sull’identità delle cellule isolate. Un altro approccio ampiamente utilizzato per l’arricchimento delle cellule staminali è la coltura tridimensionale (3D) degli sferoidi2,3,4. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti in vivo con vincoli di nicchia, subiscono la divisione cellulare nella coltura a matrice 3D (sia simmetrica che asimmetrica), generando cellule staminali e progenitrici che si riproducono rapidamente verso l’impegno di lignaggio7,8. Gli sferoidi formati sono una miscela eterogenea contenente sia cellule staminali che cellule progenitrici in varie fasi dell’impegno di lignaggio, comprese le cellule progenitrici in fase iniziale e tardiva. Pertanto, i saggi che utilizzano gli interi sferoidi non sono esclusivi per le cellule staminali, rendendo inconcludente l’identificazione di proprietà uniche delle cellule staminali. Pertanto, è fondamentale creare saggi per identificare e separare le cellule staminali della prostata dai loro progenitori figlia. A tal fine, l’obiettivo dell’attuale protocollo è quello di stabilire un sistema di analisi che consenta l’identificazione e l’isolamento efficienti delle cellule staminali dai tessuti prostata umani seguiti da una solida analisi a valle delle loro funzioni biologiche.
La ritenzione a lungo termine dell’etichetta a 5-bromo-2′-deoxyuridina (BrdU) è ampiamente utilizzata per la tracciabilità in vivo e in vitro delle cellule staminali in base al loro tempo di raddoppio prolungato9,10. L’attuale approccio per l’identificazione delle cellule staminali prostate e l’isolamento descritto qui si basa sulle loro caratteristiche quiescenti relative e sulle proprietà di ritenzione delle etichette all’interno di una popolazione epiteliale mista. Inoltre, sulla base dell’ipotesi del DNA del filamento immortale, solo le cellule staminali possono subire la divisione asimmetrica delle cellule. La cellula staminale rappresenta la cellula figlia che contiene il DNA parentale più vecchio, mentre la cellula progenitore, che è una cellula figlia impegnata, riceve il DNA appena sintetizzato. L’esclusiva proprietà delle cellule staminali descritta in precedenza viene sfruttata per eseguire l’etichettatura BrdU nelle cellule staminali parentali nelle colture primarie e quindi tenere traccia della loro etichetta dopo il lavaggio di BrdU al momento del trasferimento nella coltura di sferidi senza ancoraggio 3D. Mentre la maggior parte delle cellule epiteliali prostate primarie conservaun fenotipo basale e di transito amplificando nella coltura 2D, c’è anche una rara popolazione di cellule staminali multipotenti che ricostituiscono e mantengono l’omeostasi epiteliale come evidenziato dalla formazione di sferoidi o organoidi completamente differenziati con corrispondenti mezzi di coltura al momento del trasferimentoaisistemi 3D3,12. Nel nostro protocollo attuale, utilizzando sferoidi prostata HPrEC o brdU, CFSE o far Red ritenzioni seguite dallo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), identifichiamo cellule staminali che conservano l’etichetta negli sferoidi a livello di singola cellula13.
È importante sottolineare che abbiamo ulteriormente confermato le caratteristiche delle cellule staminali delle cellule che conservano l’etichetta all’interno di sferoidi in fase iniziale rispetto alle cellule progenitrici con impegno di lignaggio. Questi includono la divisione asimmetrica delle cellule staminali, la capacità di formazione di sferoidi in vitro e la capacità di rigenerazione dei tessuti in vivo, elevata attività dell’autofagia, biogenesi ribosomiana aumentata e diminuzione dell’attività metabolica. Successivamente, è stata eseguita l’analisi RNAseq. Sono stati osservati geni espressi in modo differenziale nelle cellule sferoidi che conservano l’etichetta che possono servire come nuovi biomarcatori per le cellule staminali della prostata umana. Questo approccio basato su sferoidi, che mantiene l’etichetta può applicarsi ai campioni di cancro per identificare in modo simile un piccolo numero di cellule staminali tumorali, fornendo così opportunità traslazionali per gestire le popolazioni resistenti terapeutiche13. Di seguito è presentato il saggio di ritenzione delle etichette basato sulla prostasfera che utilizza come esempio le cellule epiteliali primarie umane (HPrEC).
Protocol
Representative Results
Discussion
La citometria di flusso con più marcatori di superficie di cellule staminali è un approccio comunemente usato per la ricerca sulle cellule staminali, nonostante manchi sia di specificità che di selettività1,5,6. Mentre la formazione di sferoidi in un sistema di coltura 3D è un altro metodo utile per arricchire la popolazione di cellule staminali rare da cellule epiteliali primarie, tra cui HPrEC, gli sferoidi risultanti son…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Ringraziamo il Flow Cytometry Core dell’Università dell’Illinois a Chicago per l’assistenza sullo smistamento delle cellule.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referenzen
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Krebsforschung. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Krebsforschung. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
