Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales
Summary
Utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas, informamos de un nuevo método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células similares a tallos mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides. Se describe un protocolo paso a paso para el etiquetado de celdas 2D BrdU, CFSE o Far Red; formación de esferoides tridimensionales; identificación celular similar a un tallo que retiene la etiqueta por inmunocitoquímica; y aislamiento por FACS.
Abstract
A pesar de los avances en la investigación con células madre adultas, la identificación y el aislamiento de células madre de muestras de tejido sigue siendo un desafío importante. Mientras que las células madre residentes están relativamente inactivas con restricciones de nicho en los tejidos adultos, entran en el ciclo celular en cultivo tridimensional (3D) libre de anclaje y se someten a división celular simétrica y asimétrica, dando lugar tanto al tallo como al progenitor Células. Estos últimos proliferan rápidamente y son la principal población celular en varias etapas del compromiso de linaje, formando esferoides heterogéneos. Usando células epiteliales humanas normales primarias (HPrEC), se desarrolló un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides que permite la identificación y el aislamiento funcional de las células madre que inician los esferoides a una sola resolución celular.
HPrEC o líneas celulares se cultivan bidimensionalmente (2D) con BrdU durante 10 días para permitir su incorporación al ADN de todas las células divisorias, incluidas las células madre auto-renuevas. El lavado comienza tras la transferencia al cultivo 3D durante 5 días, durante los cuales las células madre se autonuevan a través de la división asimétrica e inician la formación de esferoides. Mientras que las células madre hijas relativamente inactivas conservan el ADN parental etiquetado por BrdU, los progenitores hijas proliferan rápidamente, perdiendo la etiqueta BrdU. BrdU se puede sustituir por CFSE o Far Red pro-dyes, que permiten el aislamiento de células madre vivas por FACS. Las características de las células madre se confirman mediante la formación de esferoides in vitro, ensayos de regeneración de tejido in vivo y la documentación de sus divisiones celulares simétricas/asimétricas. Las células madre aisladas que retienen etiquetas pueden ser interrogadas rigurosamente por estudios moleculares y biológicos aguas abajo, incluyendo ARN-seq, ChIP-seq, captura de células únicas, actividad metabólica, perfilado de proteome, inmunocitoquímica, formación de organoides y regeneración de tejido in vivo. Es importante destacar que este enfoque de aislamiento funcional de células madre sin marcadores identifica células similares a los tallos de muestras de cáncer fresco y líneas celulares cancerosas de múltiples órganos, lo que sugiere una amplia aplicabilidad. Se puede utilizar para identificar biomarcadores celulares similares a los tallos del cáncer, productos farmacéuticos de la pantalla dirigidos a células similares a los tallos del cáncer, y descubrir nuevas dianas terapéuticas en los cánceres.
Introduction
La glándula prostática humana contiene epitelio luminal con función secretora y células basales subyacentes junto con un componente inusual de la célula neuroendocrina. Las células epiteliales, en este caso, se generan a partir de una población rara de células madre prostáticas que están relativamente inactivas in vivo y actúan como un sistema de reparación para mantener la homeostasis glandular durante toda la vida1. A pesar de muchos avances, la identificación y el aislamiento funcional de las células madre prostáticas sigue siendo un desafío importante en el campo. Los biomarcadores de células madre, incluidas las metodologías basadas en marcadores de superficie celular combinadas con la citometría de flujo, se utilizan comúnmente para la investigación de células madre2,3,4. Sin embargo, los resultados de enriquecimiento y aislamiento varían ampliamente en función de las combinaciones de marcadores y la especificidad de los anticuerpos5,6, lo que plantea preguntas sobre la identidad de las células aisladas. Otro enfoque ampliamente utilizado para el enriquecimiento celular similar a un tallo es el cultivo esferoide tridimensional (3D)2,3,4. Mientras que las células madre residentes son relativamente indistinguen in vivo con restricciones de nicho, se someten a división celular en el cultivo de matriz 3D (tanto simétrica como asimétrica), generando células madre y progenitoras que se reproducen rápidamente hacia el compromiso de linaje7,8. Los esferoides formados son una mezcla heterogénea que contiene células madre y células progenitoras en varias etapas del compromiso de linaje, incluyendo células progenitoras en etapas tempranas y tardías. Por lo tanto, los ensayos que utilizan toda la esferoides no son exclusivos de las células madre, por lo que la identificación de propiedades únicas de células madre no es concluyente. Por lo tanto, es fundamental crear ensayos para identificar y separar las células madre de la próstata de sus progenitores hijas. Con este fin, el objetivo del protocolo actual es establecer un sistema de ensayo que permita la identificación y aislamiento eficiente de las células madre de los tejidos prostáticos humanos seguido de un sólido análisis aguas abajo de sus funciones biológicas.
La retención de etiquetas a largo plazo de 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) es ampliamente utilizada para el seguimiento in vivo e in vitro del linaje de las células madre en función de su tiempo de duplicación prolongado9,10. El enfoque actual para la identificación y el aislamiento de células madre prostáticas descritos en este documento se basa en sus propiedades relativas de característica en reposo y retención de etiquetas dentro de una población epitelial mixta. Además, sobre la base de la hipótesis inmortal del ADN de la hebra, sólo las células madre pueden someterse a la división celular asimétrica. La célula madre representa la célula hija que contiene el ADN parental más antiguo, mientras que la célula progenitora, que es una célula hija comprometida, recibe el ADN recién sintetizado. La propiedad única de células madre descrita anteriormente se explota para realizar el etiquetado BrdU en células madre parentales en cultivos primarios y luego rastrear su etiqueta después de BrdU-washout tras la transferencia al cultivo esferoide sin anclaje 3D. Mientras que la mayoría de las células epiteliales primarias de próstata conservan un fenotipo ampollador basal y de tránsito en el cultivo 2D, también hay una población rara de células madre multipotentes que reponen y mantienen la homeostasis epitelial como lo demuestra la formación de esferoides o organoides totalmente diferenciados con los medios de cultivo correspondientes al transferirlo a los sistemas 3D3,12. En nuestro protocolo actual, mediante el uso de esferoides prostíferos HPrEC o ensayos de retención BrdU, CFSE o Far Red basados en prostafera seguidos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), identificamos células madre retenedoras de etiquetas en esferoides en un solo nivel de célula13.
Es importante destacar que confirmamos además las características de las células madre de las células que retienen etiquetas dentro de los esferoides en etapa temprana en comparación con las células progenitoras con compromiso de linaje. Estos incluyen división asimétrica de células madre, capacidad de formación de esferoides in vitro y capacidad de regeneración de tejido in vivo, actividad elevada de la autofagia, biogénesis ribosoma aumentada y disminución de la actividad metabólica. Posteriormente, se realizó el análisis de ARNseq. Se observaron genes expresados diferencialmente en células esferoides que conservan etiquetas que pueden servir como nuevos biomarcadores para células madre de próstata humanas. Este enfoque de retención de etiquetas basado en esferoides puede aplicarse a las muestras de cáncer para identificar de manera similar a un pequeño número de células similares a los tallos de cáncer, proporcionando así oportunidades traslacionales para manejar las poblaciones resistentes terapéuticas13. A continuación se presenta el ensayo de retención de etiquetas basado en prostasfera utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas (HPrEC) como ejemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La citometría de flujo utilizando múltiples marcadores de superficie de células madre es un enfoque comúnmente utilizado para la investigación de células madre a pesar de carecer de especificidad y selectividad1,5,6. Mientras que la formación de esferoides en un sistema de cultivo 3D es otro método útil para enriquecer la población rara de células madre de células epiteliales primarias, incluyendo HPrEC, los esferoid…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Agradecemos al Núcleo de Citometría de Flow de la Universidad de Illinois en Chicago por su ayuda en la clasificación de células.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Referenzen
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