Isolement et caractérisation des modèles organoïdes du bassin adénoïque du pancréas dérivé par le patient
Summary
Les cultures organoïdes dérivées du patient de l’adénocarcinome canalaire pancréatique sont un modèle tridimensionnel rapidement établi qui représentent les compartiments épithélial de cellules de tumeur avec la fidélité élevée, permettant la recherche translationnelle dans cette malignité mortelle. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour établir et propager les organoïdes ainsi que pour effectuer des tests biologiques pertinents à l’aide de ces modèles.
Abstract
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est parmi les malignités les plus mortelles. Récemment, des méthodes de culture organoïde de prochaine génération permettant la modélisation tridimensionnelle (3D) de cette maladie ont été décrites. Les modèles d’organoïdes dérivés du patient (ADP) peuvent être isolés à la fois à partir de spécimens chirurgicaux ainsi que de petites biopsies et se former rapidement en culture. Fait important, les modèles organoïdes préservent les altérations génétiques pathogènes détectées dans la tumeur du patient et sont prédictifs de la réponse du patient de traitement, permettant ainsi des études translationnelles. Ici, nous fournissons des protocoles complets pour adapter le flux de travail de culture tissulaire pour étudier la 3D, la matrice incorporée, les modèles organoïdes. Nous détaillons les méthodes et les considérations pour isoler et propager les organoïdes primaires d’ACD. En outre, nous décrivons comment les médias organoïdes sur mesure sont préparés et la qualité contrôlée dans le laboratoire. Enfin, nous décrivons des essais pour la caractérisation en aval des modèles organoïdes tels que l’isolement des acides nucléiques (ADN et ARN), et le test de drogue. Il est important de fournir des considérations critiques pour la mise en œuvre de la méthodologie organoïde dans un laboratoire de recherche.
Introduction
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une maladie mortelle caractérisée par un diagnostic tardif chez la plupart des patients, un manque de thérapies efficaces, et un faible taux de survie global de 5 ans qui reste inférieur à 10%1. Seulement 20% des patients sont diagnostiqués avec une maladie localisée appropriée pour l’intervention chirurgicale curative2,3. Les patients restants sont généralement traités avec une combinaison d’agents chimiothérapeutiques qui sont efficaces dans une minorité de patients4,5. Pour répondre à ces besoins cliniques urgents, les chercheurs travaillent activement sur des stratégies de détection précoce et le développement de thérapies plus efficaces. Pour accélérer la traduction clinique d’importantes découvertes, les scientifiques utilisent des modèles de souris génétiquement modifiés, des xénogreffes dérivées du patient, des lignées de cellules monocouches et, plus récemment, des modèles organoïdes6.
La culture organoïde épithéliale tridimensionnelle utilisant le facteur de croissance et les conditions riches de Wnt-ligand pour stimuler la prolifération des cellules progénitrices non transformées ont été décrites d’abord pour l’intestin de souris7 et ont été rapidement adaptées au tissu pancréatique humain normal8. En plus du tissu canalaire normal, la méthodologie organoïde permet l’isolement, l’expansion, et l’étude de PDAC humain8. Fait important, la méthode soutient l’établissement d’organoïdes à partir de spécimens chirurgicaux, ainsi que des biopsies fines et de l’aiguille de base, permettant aux chercheurs d’étudier toutes les étapes de la maladie9,10. Intéressant, les organoïdes patients-dérivés récapitulent les sous-types transcriptomiques bien décrits de tumeur bien décrits et peuvent permettre le développement des plates-formes de médecine de précision9,11.
Les protocoles organoïdes actuels pour PDAC permettent l’expansion réussie de plus de 70% des échantillons de patients des patients chimio-naïfs9. Ici, nous présentons les méthodes standard employées par notre laboratoire pour isoler, élargir, et caractériser les organoïdes PDAC patients-dérivés. D’autres méthodologies organoïdes de PDAC ont été décrites12,13 mais aucune comparaison de ces méthodes n’a été complètement exécutée. Comme cette technologie est relativement nouvelle et progresse rapidement, nous nous attendons à ce que ces protocoles continuent d’évoluer et de s’améliorer; cependant, les principes de la manipulation des tissus et de la culture organoïde continueront d’être utiles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons des protocoles actuels pour isoler, élargir et caractériser les organoïdes PDAC dérivés du patient. Notre taux de réussite actuel d’établir la culture organoïde est plus de 70% ; par conséquent, ces méthodes n’ont pas encore été perfectionnés et devraient s’améliorer et évoluer au fil du temps. Une considération importante devrait être accordée à la taille de l’échantillon, car pDAC a une faible cellularité néoplastique. Par conséquent, les petits spécimens contiendront peu d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants pour le soutien de l’UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, les membres du laboratoire Lowy, et le DÉPARTEMENT de chirurgie de l’UC San Diego, Division of Surgical Oncology. AML est généreusement soutenu par NIH CA155620, un SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), et les donateurs au Fonds pour guérir le cancer du pancréas.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referenzen
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