Aislamiento y caracterización de modelos de organoide de adenocarcinoma ductal pancreático derivados del paciente
Summary
Los cultivos organoides derivados del paciente de adenocarcinoma ductal pancreático son un modelo tridimensional rápidamente establecido que representa compartimentos de células tumorales epiteliales con alta fidelidad, lo que permite la investigación traslacional sobre esta malignidad letal. Aquí, proporcionamos métodos detallados para establecer y propagar organoides, así como para realizar ensayos biológicos relevantes utilizando estos modelos.
Abstract
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) se encuentra entre los tumores malignos más letales. Recientemente, se han descrito métodos de cultivo organoides de próxima generación que permiten el modelado tridimensional (3D) de esta enfermedad. Los modelos de organoides (DOP) derivados del paciente pueden aislarse tanto de muestras quirúrgicas como de pequeñas biopsias y formarse rápidamente en el cultivo. Es importante destacar que los modelos organoides preservan las alteraciones genéticas patógenas detectadas en el tumor del paciente y son predictivos de la respuesta al tratamiento del paciente, permitiendo así estudios traslacionales. Aquí, proporcionamos protocolos integrales para adaptar el flujo de trabajo de cultivo de tejidos para estudiar modelos de organoides 3D, matriz incrustada. Detallamos métodos y consideraciones para aislar y propagar organoides PDAC primarios. Además, describimos cómo se preparan los medios organoides a medida y se controla la calidad en el laboratorio. Por último, describimos los ensayos para la caracterización posterior de los modelos organoides, como el aislamiento de ácidos nucleicos (ADN y ARN), y las pruebas de fármacos. Es importante destacar que proporcionamos consideraciones críticas para implementar la metodología organoide en un laboratorio de investigación.
Introduction
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad letal caracterizada por un diagnóstico tardío en la mayoría de los pacientes, una falta de terapias eficaces y una tasa de supervivencia global de 5 años resultante que permanece inferior al 10%1. Sólo el 20% de los pacientes son diagnosticados con una enfermedad localizada adecuada para la intervención quirúrgica curativa2,3. Los pacientes restantes son típicamente tratados con una combinación de agentes quimioterápicos que son eficaces en una minoría de pacientes4,5. Para hacer frente a estas necesidades clínicas apremiantes, los investigadores están trabajando activamente en estrategias de detección temprana y el desarrollo de terapias más eficaces. Para acelerar la traducción clínica de descubrimientos importantes, los científicos están empleando modelos de ratón genéticamente diseñados, xenoinjertos derivados del paciente, líneas de células monocapa y, más recientemente, modelos organoides6.
Cultivo organoide epitelial tridimensional utilizando factor de crecimiento y condiciones ricas en Wnt-ligand para estimular la proliferación de células progenitoras no transformadas se describieron por primera vez para el intestino del ratón7 y se adaptaron rápidamente al tejido pancreático humano normal8. Además del tejido ductal normal, la metodología organoidea permite el aislamiento, expansión y estudio de PDAC8humano. Es importante destacar que el método apoya el establecimiento de organoides a partir de muestras quirúrgicas, así como biopsias finas y de agujas de núcleo, permitiendo a los investigadores estudiar todas las etapas de la enfermedad9,10. Curiosamente, los organoides derivados del paciente recapitulan subtipos transcriptómicos tumorales bien descritos y pueden permitir el desarrollo de plataformas de medicina de precisión9,11.
Los protocolos organoides actuales para PDAC permiten la expansión exitosa de más del 70% de las muestras de pacientes de pacientes quimio-nave9. Aquí presentamos los métodos estándar empleados por nuestro laboratorio para aislar, expandir y caracterizar los organoides PDAC derivados del paciente. Se han descrito otras metodologías de organoides de PDAC12,13, pero no se ha realizado a fondo ninguna comparación de estos métodos. Como esta tecnología es relativamente nueva y avanza rápidamente, esperamos que estos protocolos continúen evolucionando y mejorando; sin embargo, los principios del manejo de los tejidos y el cultivo organoide seguirán siendo útiles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos protocolos actuales para aislar, expandir y caracterizar organoides PDAC derivados del paciente. Nuestra tasa de éxito actual de establecer el cultivo organoide es de más del 70%; por lo tanto, estos métodos aún no se han perfeccionado y se espera que mejoren y evolucionen con el tiempo. Se debe tener en cuenta el tamaño de la muestra, ya que PDAC tiene una celularidad neoplásica baja. En consecuencia, los especímenes pequeños contendrán pocas células tumorales, y sólo generarán un puñado …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo del UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, miembros del laboratorio Lowy, y el Departamento de Cirugía de UC San Diego, División de Oncología Quirúrgica. AML cuenta con el generoso apoyo de NIH CA155620, un su2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16) y donantes al Fondo para Curar el Cáncer De Páncreas.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referenzen
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