Изоляция и характеристика пациента полученных поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома ОрганоидНые Модели
Summary
Органоидные культуры, полученные пациентом, аденокарциномы поджелудочной железы представляют собой быстро устанавливаемую трехмерную модель, представляющую эпителиальные отсеки опухолевых клеток с высокой точностью, что позволяет проводить трансляционные исследования этой смертельной злокачественности. Здесь мы предоставляем подробные методы для установления и распространения органоидов, а также для выполнения соответствующих биологических анализов с использованием этих моделей.
Abstract
Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертоносных злокачественных новообразований. Недавно были описаны методы органоидной культуры следующего поколения, позволяющие трехмерное (3D) моделирование этого заболевания. Модели органоидов, полученных из пациента (PDO), могут быть изолированы как из хирургических образцов, так и из небольших биопсий и быстро формироваться в культуре. Важно отметить, что органоидные модели сохраняют патогенные генетические изменения, обнаруженные в опухоли пациента, и являются прогностическими реакции пациента на лечение, что позволяет проводить трансляционные исследования. Здесь мы предоставляем комплексные протоколы для адаптации рабочего процесса культуры тканей для изучения 3D, матрицы встроенных, органоидных моделей. Мы подробно методы и соображения для изоляции и распространения первичных органов PDAC. Кроме того, мы описываем, как заказ органоидных средств массовой информации готовится и качество контролируется в лаборатории. Наконец, мы описываем анализы для ниже по течению характеристики органоидных моделей, таких как изоляция нуклеиевых кислот (ДНК и РНК), и тестирование на наркотики. Важно отметить, что мы предоставляем критические соображения для внедрения органоидной методологии в исследовательской лаборатории.
Introduction
Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является смертельной болезнью, характеризующейся поздней диагностикой у большинства пациентов, отсутствием эффективных методов лечения и, как следствие, низким 5-летним общим показателем выживаемости, которое остается менее 10%1. Только у 20% пациентов диагностировано локализованное заболевание, пригодное для лечебного хирургического вмешательства2,3. Остальные пациенты, как правило, лечатся с сочетанием химиотерапевтических средств, которые эффективны в меньшинстве пациентов4,5. Для удовлетворения этих насущных клинических потребностей, исследователи активно работают над стратегиями раннего обнаружения и разработки более эффективных методов лечения. Для ускорения клинического перевода важных открытий, ученые используют генетически модифицированные модели мыши, пациент производные ксенотрансплантатов, монослойных клеток линий, и, совсем недавно, органоидных моделей6.
Трехмерная эпителиальная органоидная культура с использованием фактора роста и wnt-ligand богатых условиях для стимулирования пролиферации непреобразованных клеток-прародителей были впервые описаны для мышиного кишечника7 и были быстро адаптированы к нормальной ткани поджелудочной железы человека8. В дополнение к нормальной протоковой ткани, органоидная методология позволяет для изоляции, расширения и изучения человека PDAC8. Важно отметить, что метод поддерживает создание органоидов из хирургических образцов, а также тонкой и основной биопсии иглы, что позволяет исследователям изучить все стадии заболевания9,10. Интересно, что органоиды, полученные из пациента, резюмируют хорошо описанные опухолевые транскриптомические подтипы и могут способствовать развитию платформ точной медицины9,11.
Текущие органоидные протоколы для PDAC позволяют успешно расширить более 70% образцов пациентов у пациентов с химио-наивными9. Здесь мы представляем стандартные методы, используемые нашей лабораторией для изоляции, расширения и характеристики органов PDAC, полученных от пациента. Другие методы PDAC органоидные были описаны12,13, но не сравнение этих методов была тщательно выполнена. Поскольку эта технология является относительно новой и быстро развивается, мы ожидаем, что эти протоколы будут продолжать развиваться и совершенствоваться; однако принципы обработки тканей и органоидной культуры будут по-прежнему полезны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем текущие протоколы для изоляции, расширения и характеристики органов PDAC, полученных от пациента. Наш текущий показатель успеха создания органоидной культуры составляет более 70%; поэтому эти методы еще не усовершенствованы и, как ожидается, будут совершенствоватьс…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за поддержку UC Сан-Диего Мурс онкологический центр Biorepository и ткани технологии Общие ресурсы, члены лаборатории Лоуи, и UC Сан-Диего Департамент хирургии, Отдел хирургической онкологии. AML щедро поддерживается NIH CA155620, SU2C CRUK Lustgarten Фонд поджелудочной железы Рак Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), и доноры Фонда по лечению рака поджелудочной железы.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referenzen
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
