JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

قياس ديناميات الأنابيب المجهرية بواسطة المجهر القرص الغزل في المغزل ميتوتيك القطب

Published: November 15, 2019
doi:
10.3791/60478
,
1AG Oncophysiology,Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

نقدم هنا طريقه قويه ومفصله لتحليل ديناميات البولية المجهرية في الخلايا المتزامنة في طليعة باستخدام الخلية الحية الغزل القرص المجهري المجهر ومعالجه الصور المستندة إلى matlab.

Abstract

ونحن نقدم وصفا لتعديل طريقه محدده لتحديد ديناميات البولية الصغيرة في الخلايا الحية. ويستند البروتوكول علي التعبير عن علامة المشفرة وراثيا لغايات ايجابيه من الأنابيب الدقيقة (EB3 الموسومة مع بروتين الفلورسنت tdTomato) وعاليه السرعة, عاليه الدقة, التصوير الخلوي الحي باستخدام القرص الدوار المجهر المجهري. يتم تحقيق تزامن دوره الخلية وزيادة كثافة الأنابيب الدقيقة من خلال تثبيط الانفصال الوسطي في الخلايا المتصوقيه ، ويتم اجراء تحليل النمو باستخدام برنامج المسار المفتوح المصدر. ان استخدام بروتين فلوري مشرق واحمر اللون ، بالاشتراك مع طاقة الليزر المنخفضة ووقت التعرض المنخفض المطلوب لدوران القرص المجهري يقلل من السمية الضوئية واحتمال القطع الاثريه المستحثة ضوئيا. وهذا يسمح بتصوير عدد أكبر من الخلايا في نفس الاعداد مع الحفاظ علي الخلايا في وسط النمو في ظل ظروف الثقافة القياسية. ونظرا لان التحليل يتم بطريقه تلقائية خاضعه للاشراف ، فان النتائج قويه إحصائيا وقابله للتكرار.

Introduction

الأنابيب المجهرية (MTs) هي هياكل ديناميكية للغاية وجدت في جميع الخلايا الحقيقية النواة تقريبا وفي بعض البكتيريا1. مع [اكتين] وخيوط متوسطه, ينحت هم [ستوسيكلتون]2,3. تقسيم الخلية4، جزيء النقل5، الضرب الصواري6، والإحساس من البيئة المحيطة من خلال الابتدائية هدب7، السمع (kinocilium)8،9، الاجنه10،11،12، الغزو وورم خبيث13،14، وحتى تكوين الذاكرة15،16،17،18، والعديد من العمليات الأخرى تعتمد أساسا علي MTs. سيكون من المستحيل مشاركه الmts في جميع هذه الاحداث دون قدرتها الملحوظة علي التحول بسرعة بين النمو (البلمره) والانكماش (التحلل). وصفت هذه الخاصية بأنها عدم الاستقرار الديناميكي19. يتم تغيير MT ديناميستي في العديد من الحالات المرضية20،21،22. التالي ، فان تحديد طبيعة هذه الخاصية يمكن ان يساعد علي فهم أليات المرض وبعد ذلك معالجتها.

وقد وضعت قائمه طويلة من الأساليب لتحليل ديناميات MT, معظمها تستند إلى تقنيات التصوير23. في البداية ، تم استخدام المجاهر الضوئية واسعه المجال لمراقبه تشكيل أنابيب البوليمرات في المختبر24. الاكتشاف من [ند-كندينغ] ([ب])-بروتينات ان يجمع في [مت] [بلس-نهاي] والتطوير الطرق إلى فلوريسسينتلي تسميه بروتينات جعل هو يمكن ان يلاحظ التصرف ال [MTs] مباشره في [ليفينغ سل] مع مجال واسعه و [كونككلر] مجاهر مجهر25,26,27. واحده [آيب-بروتين] [ند-بيندينغ] بروتين 3 (EB3)28; من خلال التعبير المفرط وتتبع EB3 تنصهر إلى بروتين الفلورسنت ، يمكن تحديد معدلات التجميع MT plus-نهاية29،30.

وكثيرا ما يستخدم المجهر الضوئي الليزر البؤري المجهري (CLSM) لمتابعه ديناميات MT. ومع ذلك ، فان تقنيه التصوير هذه تشكل خطرا عاليا من السمية الضوئية والرشح الضوئي ، وهما عمليتان غير مرغوب فيهما للخلايا الحية وعينات التصوير الخافتة31. من أجل الحصول علي نسبه أفضل من الاشاره إلى الضوضاء ، يجب ان تكون قوه الليزر ومده التعرض عاليه بما يكفي في حين لا تضر العينات ، وهذا يتطلب التضحية بالقرار في مقابل السرعة. بديل مناسب ل CLSM هو الغزل القرص المجهر32. ويستند هذا الأسلوب التصوير علي استخدام القرص Nipkow33، والذي يتكون من قرص متحرك تحمل مجموعه من الثقوب ، ويعمل اي ما يعادل إلى العديد من المجاهر CLS التصوير نفس العينة في وقت واحد34. ولذلك ، فان الضوء من الليزر سوف تضيء عده مناطق في العينة في وقت واحد ولكن الحفاظ علي الطبيعة المحورية. التالي ، فان قرص Nipkow يسمح بالحصول علي صور مشابهه ل CLSM ولكن بشكل أسرع وباستخدام طاقة ليزر اقل. تم تحسين القرص Nipkow كذلك من قبل Yokogawa الكهربائية, التي أدخلت القرص الثاني مع مجموعه من العدسات الدقيقة علي ذلك ان الضوء المباشر بشكل فردي في ثقب الدبوس المعنية, مزيد من الحد من السمية الضوئية والتصوير الضوئي35. وهكذا, الغزل القرص الليزر المسح المجهري أصبحت طريقه الاختيار للتصوير الخلية الحية, ويجعل من الممكن الحصول علي الصور مع ارتفاع نسبه الاشاره إلى الضوضاء في سرعه عاليه31,36, وهو أمر حاسم لحل الإشارات مثل تلك من نهايات MT سريعة النمو.

ديناميات MT تختلف مؤقتا. علي سبيل المثال ، ميتيك MTs هي أكثر ديناميكية من تلك المرحلة البينية37،38. المثل ، لوحظت الاختلافات في معدل النمو والانكماش حتى داخل نفس مرحله دوره الخلية ، مثل انقسام39،40. لذلك ، لتجنب جمع البيانات الزائفة ، يجب ان يقتصر قياس ديناميات MT علي اطار زمني ضيق اثناء دوره الخلية. علي سبيل المثال ، يمكن تحقيق قياس ديناميات MT في طليعة عن طريق علاج الخلايا مع dimethylenastron (DME) ، وهو التناظرية monastrol الذي يمنع المحرك كينيسن Eg541 ويمنع تشكيل المغزل القطبين القطبية42. تثبيط الخلايا في طليعة مع مثبطات Eg5 DME وغيرها من المشتقات monastrol لا يؤثر علي mt ديناميات43،44،45، مما يجعل من DME أداه مفيده لدراسة ديناميات mt علي حد سواء في الخلايا الثابتة والحية44.

هنا نحن الجمع بين طريقه تحليل ديناميات MT في الخلايا بروتافاز الموصوفة من قبل Ertych وآخرون44 مع التصوير المزدوج القرص الغزل. يسمح هذا الأسلوب قياس ديناميات MT في الخلايا prometase التي تم جمعها من المستوي البؤري واحد مع معدل التصوير اعلي ، ولكن دون الرشح الضوئي والحد الأدنى من السمية الضوئية. وعلاوة علي ذلك ، وكمراسل الفلورسنت ، ونحن نستخدم البروتينات الفلورية ديمر الطماطم (tdtomato) التي تحسنت السطوع والاستقرار الضوئي بالمقارنة مع البروتين الفلوري الأخضر (egfp) ومتحمس مع انخفاض الطاقة الخفيفة46. لذلك ، يتطلب tdTomato طاقة ليزر اقل للاثاره واقل سميه ضوئيه. الإجمال ، فاننا نقوم بتحسين الطريقة من خلال الحد من السمية الضوئية وتحسين الدقة والمعالجة اللاحقة المطلوبة لتحليل ديناميات MT. بالاضافه إلى ذلك ، نقوم بإنشاء أساس للتعديلات المستقبلية للأسلوب عن طريق الجمع بينها وبين تقنيات التزامن الأخرى.

Protocol

1. بذر الخلايا هيلا اعداد 2 مل من 5 ميكروغرام/مل الفيبرونكتين جنيني الحل في الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية) وأضافه 450 μl منه في كل بئر من 4 بشكل جيد مكفرشفه (#1.5). احتضان الشريحة لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. شطف خلايا هيلا المتنامية بشكل غير متزامن مع الفوسفات المخزن ?…

Representative Results

وبعد البروتوكول المحدد المبين في الشكل 1A، تم التعبير عن pEB3 في خلايا هيلا المتنامية بصوره غير متزامنة. تمت مزامنة الخلايا 48 h بعد التحويل في طليعة من خلال العلاج DME (الشكل 1b). وكفلت هذه الخطوة ان يكون قياس ديناميات MT دائما في نفس المرحلة من دوره الخلية. وتمت معا…

Discussion

هنا ، ونحن وصف تعديلا للأسلوب الذي انشاته Ertych وآخرون44. مع العديد من التعديلات الأخرى ، ونحن الجمع بين هذه التقنية من تحليل ديناميات MT مع المزدوج الغزل القرص التصوير البؤري. استخدام القرص الدوار المزدوج يحسن دقه النامية MTs مع الحد من السمية الضوئية36. كما نقوم بتقلي…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر أعضاء مرفق المجهر الضوئي ، معهد ماكس بلانك للطب التجريبي ، علي مشورتهم المتخصصة ودعمهم.

Materials

Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. . Methods in Molecular Biology. , (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy — a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Nipkow, P. Elektrisches teleskop. Germany patent. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Tanaami, T., Kenta, M. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. , (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -. M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D’Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -. S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

Keywords: Microtubule DynamicsSpinning Disk MicroscopyMonopolar Mitotic SpindlesFluorescent ProteinPhototoxicityEB3TrypsinizationHeLa CellsTransfectionDimethylenastron (DME)
check_url/de/60478?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image