Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch Spinnen der Disk-Mikroskopie in Monopolar-Mitotischen Spindeln

Summary

Hier stellen wir eine robuste und detaillierte Methode der Mikrotubuli-Dynamikanalyse in Zellen vor, die in der Prometaphase mit Live-Zell-Spinnscheibe konfokaler Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung synchronisiert werden.

Abstract

Wir beschreiben eine Modifikation einer etablierten Methode zur Bestimmung der Mikrotubuli-Dynamik in lebenden Zellen. Das Protokoll basiert auf der Expression eines genetisch kodierten Markers für die positiven Enden von Mikrotubuli (EB3 mit tdTomato fluoreszierendem Protein) und hochgeschwindigkeits-, hochauflösender Live-Zell-Bildgebung mittels konokaler Spinnenvon-Mikroskopie. Die Zellzyklussynchronisierung und die erhöhte Dichte von Mikrotubuli werden durch Hemmung der zentrosomalen Trennung in mitotischen Zellen erreicht, und die Analyse des Wachstums wird mit Open-Source-U-Track-Software durchgeführt. Die Verwendung eines hellen und rot verschiebbaren fluoreszierenden Proteins in Kombination mit der geringeren Laserleistung und der reduzierten Belichtungszeit, die für die Spinnendere benötigt wird, reduziert die Phototoxizität und die Wahrscheinlichkeit lichtinduzierter Artefakte. Dies ermöglicht die Abbildung einer größeren Anzahl von Zellen in der gleichen Zubereitung unter Beibehaltung der Zellen in einem Wachstumsmedium unter Standardkulturbedingungen. Da die Analyse in einer überwachten automatischen Weise durchgeführt wird, sind die Ergebnisse statistisch robust und reproduzierbar.

Introduction

Mikrotubuli (MTs) sind hochdynamische Strukturen, die in praktisch allen eukaryotischen Zellen und in einigen Bakterien gefunden werden¹. Zusammen mit Aktin und Zwischenfilamenten formen sie das Zytoskelett^2,3. Zellteilung⁴, Molekültransport⁵, Flagellar schlagen⁶, das Gefühl der Umgebung durch primärecilium⁷, Hören (Kinocilium)^8,9, Embryogenese^10,11,12, Invasion und Metastasierung^13,14, und sogar Gedächtnisbildung^15,16,17,18, und viele andere Prozesse verlassen sich in erster Linie auf MTs. Die Teilnahme von MTs an all diesen Ereignissen wäre ohne ihre bemerkenswerte Fähigkeit, schnell zwischen Wachstum (Polymerisation) und Schrumpfung (Depolymerisation) zu wechseln, nicht möglich. Diese Eigenschaft wird als dynamische Instabilität¹⁹beschrieben. MT-Dynamik wird unter vielen pathologischen Bedingungen verändert^20,21,22. Daher kann die Bestimmung der Art dieser Eigenschaft helfen, Krankheitsmechanismen und anschließend ihre Behandlung zu verstehen.

Für die MT-Dynamikanalyse wurde eine lange Liste von Methoden entwickelt, von denen die meisten auf bildgebenden Verfahren basieren²³. Ursprünglich wurden Weitfeldlichtmikroskope zur Beobachtung der Bildung von Tubulinpolymeren in vitro²⁴eingesetzt. Die Entdeckung von Endbindungsproteinen (EB)-Proteinen, die sich an MT-Plus-Ends sammeln, und die Entwicklung von Methoden zur fluoreszierenden Kennzeichnung von Proteinen ermöglichten es, das Verhalten von MTs direkt in lebenden Zellen mit Weitfeld- und konfokalen Fluoreszenzmikroskopen^25,26,27zu beobachten. Ein EB-Protein ist endbindendes Protein 3 (EB3)²⁸; durch Überexpression und Verfolgung von EB3, das zu einem fluoreszierenden Protein verschmolzen wird, können MT-Plus-End-Montageraten bestimmt werden^29,30.

Die konfokale Laserscanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) wird häufig verwendet, um der MT-Dynamik zu folgen. Diese bildgebende Technik stellt jedoch ein hohes Risiko für Phototoxizität und Photobleaching, zwei unerwünschte Prozesse für lebende Zellen und dim Probenbildgebung³¹. Um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, sollten die Laserleistung und die Belichtungsdauer hoch genug sein, ohne die Proben zu beschädigen, und dies erfordert eine Aufblätung der Auflösung im Austausch für Geschwindigkeit. Eine geeignete Alternative zu CLSM ist die Spinnscheibenmikroskopie³². Diese bildgebende Modalität basiert auf der Verwendung einer Nipkow-Scheibe³³, die aus einer beweglichen Scheibe besteht, die eine Reihe von Lochlöchern trägt, und arbeitet äquivalent zu vielen CLS-Mikroskopen, die die gleiche Probe gleichzeitig darstellen³⁴. Daher leuchtet das Licht des Lasers mehrere Bereiche in der Probe gleichzeitig, behält aber die konfokale Natur bei. Die Nipkow-Festplatte ermöglicht es daher, Bilder zu erhalten, die CLSM ähneln, aber schneller und mit weniger Laserleistung. Die Nipkow-Scheibe wurde von Yokogawa Electric weiter verbessert, die eine zweite Scheibe mit einer Reihe von Mikrolinsen auf sie einführte, die einzeln Licht in ein entsprechendes Loch leiten, wodurch Phototoxizität und Photobleichung weiter reduziert werden³⁵. So wurde die Spinnscheiben-Laserscanmikroskopie zu einer Methode der Wahl für die Live-Zell-Bildgebung, und es ermöglicht, Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis bei einer hohen Geschwindigkeit^{von 31,36}zu erhalten, was für das Auflösen von Signalen wie denen von den schnell wachsenden MT-Enden entscheidend ist.

Mt-Dynamik unterscheidet sich vorübergehend. Beispielsweise sind die mitotischen MTs dynamischer als die Interphase-MTs^37,38. In ähnlicher Weise wurden Unterschiede in der Wachstumsrate und Schrumpfung sogar innerhalb derselben Zellzyklusphase beobachtet, wie Mitose^39,40. Um eine falsche Datenerfassung zu vermeiden, sollte die Messung der MT-Dynamik daher während des Zellzyklus auf ein enges Zeitfenster beschränkt werden. Zum Beispiel kann die Messung der MT-Dynamik in der Prometaphase durch die Behandlung der Zellen mit Dimethylenastron (DME) erreicht werden, einem monastrolen Analogon, das die Motorkinus eg5⁴¹ hemmt und die Bildung der bipolaren Mitotischen Spindel⁴²verhindert. Die Hemmung von Zellen in der Prometaphase mit Eg5-Hemmer DME und anderen monastrolen Derivaten hat keinen Einfluss auf die MT-Dynamik^43,44,45, was DME zu einem nützlichen Werkzeug für die Untersuchung der MT-Dynamik sowohl in festen als auch in lebenden Zellen macht⁴⁴.

Hier kombinieren wir die von Ertych et^{al. 44} beschriebene Methode der MT-Dynamikanalyse in Prometaphasenzellen mit dualspinnierender Scheibenbildgebung. Diese Methode ermöglicht die Messung der MT-Dynamik in Prometaphasenzellen, die von einer einzigen Fokalebene mit einer höheren Bildrate, jedoch ohne Photobleichung und minimale Phototoxizität gesammelt wurden. Darüber hinaus verwenden wir als fluoreszierender Reporter Tandem-Dimer Tomato fluorescent protein (tdTomato), das die Helligkeit und Photostabilität im Vergleich zum grünen Fluoreszenzprotein (EGFP) verbessert hat und mit weniger Energielicht⁴⁶angeregt wird. Daher benötigt tdTomato weniger Laserleistung für die Anregung und ist weniger fototoxisch. Insgesamt verbessern wir die Methode weiter, indem wir die Phototoxizität reduzieren und die Auflösung und Nachbearbeitung verbessern, die für die MT-Dynamikanalyse erforderlich sind. Darüber hinaus schaffen wir eine Grundlage für zukünftige Änderungen der Methode, indem wir sie mit anderen Synchronisationstechniken kombinieren.

Protocol

1. Aussaat von HeLa-Zellen Bereiten Sie 2 ml mit 5 g/ml Fibronectin-Lösung in Phosphatgepufferter Saline (PBS) vor und fügen Sie 450 l davon in jeden Brunnen eines 4 gut gekammerten Deckellips (#1.5) ein. Inkubieren Sie den Schlitten 15 min bei 37 °C und 5%CO2. Asynchron wachsende HeLa-Zellen mit Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline (DPBS) abspülen und mit Trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) 5 min bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch die Zugabe von Roswell Park…

Representative Results

Nach dem in Abbildung 1Abeschriebenen Protokoll wurde das pEB3-tdTomato-Plasmid vorübergehend in asynchron wachsenden HeLa-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion bei Prometaphase durch DME-Behandlung synchronisiert (Abbildung 1B). Dieser Schritt sorgte dafür, dass die Messung der MT-Dynamik immer in der gleichen Phase des Zellzyklus durchgeführt wurde. Die Zeitrafferfilme wurden mit U-Track v2.2.0, wie in der Ergänzenden Dokumentatio…

Discussion

Hier beschreiben wir eine Modifikation einer Methode, die zuerst von Ertych et al.⁴⁴etabliert wurde. Zusammen mit einigen anderen Modifikationen kombinieren wir diese Technik der MT-Dynamikanalyse mit der konfokalen Bildgebung der Doppelspinnscheibe. Die Verwendung der Doppelspinnscheibe verbessert die Auflösung wachsender MTs und reduziert gleichzeitig die Phototoxizität³⁶. Wir reduzieren die Photobleaching- und Laserlichtschäden der Zellen weiter, indem wir zu einem fl…

Materials

Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software