Mesure de la dynamique des microtubules par la microscopie du disque filature dans des spindles mitotiques monopolaires

Summary

Ici nous présentons une méthode robuste et détaillée d’analyse de dynamique de microtubule dans les cellules synchronisées dans prometaphase utilisant la microscopie confocale de disque de filature de cellules vivantes et le traitement d’image MATLAB-basé.

Abstract

Nous décrivons une modification d’une méthode établie pour déterminer la dynamique de microtubule dans les cellules vivantes. Le protocole est basé sur l’expression d’un marqueur génétiquement codé pour les extrémités positives des microtubules (EB3 étiquetés avec la protéine fluorescente tdTomato) et à haute vitesse, haute résolution, imagerie à cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale du disque filature. La synchronisation du cycle cellulaire et l’augmentation de la densité des microtubules sont obtenues en inhibant la séparation centrosomale dans les cellules mitotiques, et l’analyse de la croissance est effectuée à l’aide du logiciel Open-Track. L’utilisation d’une protéine fluorescente brillante et rouge décalée, en combinaison avec la puissance laser inférieure et le temps d’exposition réduit requis pour la microscopie de disque de rotation réduisent la phototoxicité et la probabilité des artefacts induits par la lumière. Cela permet d’imagerie d’un plus grand nombre de cellules dans la même préparation tout en maintenant les cellules dans un milieu de croissance dans des conditions de culture standard. Étant donné que l’analyse est effectuée de façon automatique supervisée, les résultats sont statistiquement robustes et reproductibles.

Introduction

Les microtubules (MT) sont des structures très dynamiques que l’on trouve dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes et dans certaines bactéries¹. Avec l’actine et les filaments intermédiaires, ils sculptent le cytosquelette^2,3. Division cellulaire⁴, transport de molécules⁵, flagellateur battant⁶, la sensation de l’environnement environnant à travers le cilium primaire⁷, audition (kinocilium)^8,9, embryogenèse^10,11,12, invasion et métastes^13,14, et même la formation de la mémoire^15,16,17,18, et beaucoup d’autres processus reposent principalement sur les MT. La participation des MT à tous ces événements serait impossible sans leur remarquable capacité à passer rapidement de la croissance (polymérisation) au rétrécissement (dépolymérisation). Cette propriété est décrite comme l’instabilité dynamique¹⁹. La dynamique MT est altérée dans de nombreuses conditions pathologiques^20,21,22. Par conséquent, la détermination de la nature de cette propriété peut aider à comprendre les mécanismes de la maladie et, par la suite, leur traitement.

Une longue liste de méthodes a été développée pour l’analyse de la dynamique MT, dont la plupart sont basées sur des techniques d’imagerie²³. Initialement, des microscopes à lumière à large champ ont été utilisés pour observer la formation de polymères de tubuline in vitro²⁴. La découverte de protéines liantes finales (EB) qui s’accumulent à MT plus-ends et le développement de méthodes pour étiqueter les protéines fluorescentes ont permis d’observer le comportement des MT directement dans les cellules vivantes avec large champ et microscopes à fluorescence confocale^25,26,27. Une protéine EB est la protéine liant fin 3 (EB3)²⁸; en surexprimant et en suivant EB3 fusionné à une protéine fluorescente, les taux d’assemblage MT plus-extrémité peuvent être déterminés^29,30.

La microscopie par fluorescence par laser confocal (CLSM) est fréquemment utilisée pour suivre la dynamique du MT. Cependant, cette technique d’imagerie pose un risque élevé de phototoxicité et de photoblanchiment, deux processus indésirables pour les cellules vivantes et l’imagerie de l’échantillon faible³¹. Afin d’obtenir un meilleur rapport signal-bruit, la puissance laser et la durée d’exposition doivent être suffisamment élevées tout en n’endommageant pas les échantillons, ce qui nécessite de sacrifier la résolution en échange de la vitesse. Une alternative appropriée au CLSM est la microscopie de disque tournante³². Cette modalité d’imagerie est basée sur l’utilisation d’un disque Nipkow³³, qui se compose d’un disque en mouvement portant un tableau de trous d’épingle, et fonctionne de façon équivalente à de nombreux microscopes CLS imagerie du même échantillon simultanément³⁴. Par conséquent, la lumière du laser illuminera plusieurs régions de l’échantillon simultanément, mais conservera la nature confocale. Le disque Nipkow permet donc d’obtenir des images similaires à CLSM, mais plus rapidement et en utilisant moins de puissance laser. Le disque Nipkow a été encore amélioré par Yokogawa Electric, qui a introduit un deuxième disque avec un tableau de microlentilles sur elle que la lumière individuellement diriger dans un trou d’épingle respectif, réduisant encore la phototoxicité et photoblanchiment³⁵. Ainsi, la microscopie de balayage laser de disque de rotation est devenue une méthode de choix pour l’imagerie cellulaire vivante, et il permet d’obtenir des images avec le rapport signal-bruit élevé à une vitesse élevée^31,36, qui est crucial pour résoudre des signaux tels que ceux des extrémités de MT à croissance rapide.

La dynamique MT diffère temporairement. Par exemple, les MT mitotiques sont plus dynamiques que les MT^{interphases 37,38}. De même, des différences dans le taux de croissance et le rétrécissement ont été observées même au sein de la même phase du cycle cellulaire, comme la mitose^39,40. Par conséquent, pour éviter la collecte de fausses données, la mesure de la dynamique MT devrait être limitée à une fenêtre temporelle étroite pendant le cycle cellulaire. Par exemple, la mesure de la dynamique de MT dans prometaphase peut être réalisée en traitant les cellules avec le diméthylenastron (DME), un analogue monastrol qui inhibe la kinésine de moteur Eg5⁴¹ et empêche la formation du fuseau mitotique bipolaire^42. L’inhibition des cellules à proméaphase avec Eg5 inhibiteur DME et autres dérivés monastrol n’affecte pas la dynamique MT^43,44,45, ce qui rend DME un outil utile pour étudier la dynamique MT à la fois dans les cellules fixes et vivantes⁴⁴.

Ici nous combinons la méthode de l’analyse de dynamique de MT dans les cellules de proméaphase décrites par Ertych et autres⁴⁴ avec la formation image de disque de double rotation. Cette méthode permet de mesurer la dynamique mT dans les cellules proméaphase recueillies à partir d’un seul plan focal avec un taux d’imagerie plus élevé, mais sans photoblanchiment et phototoxicité minimale. En outre, en tant que journaliste fluorescent, nous utilisons tandem dimer protéine fluorescente tomate (tdTomato) qui a amélioré la luminosité et la photostabilité par rapport à la protéine fluorescente verte (EGFP) et est excité avec une lumière d’énergie plus faible⁴⁶. Par conséquent, tdTomato nécessite moins de puissance laser pour l’excitation et est moins phototoxique. Au total, nous améliorons encore la méthode en réduisant la phototoxicité et en améliorant la résolution et le post-traitement requis pour l’analyse de la dynamique MT. En outre, nous créons une base pour les modifications futures de la méthode en la combinant avec d’autres techniques de synchronisation.

Protocol

1. Ensemencement des cellules HeLa Préparer 2 ml de solution de fibronectin de 5 g/mL dans la saline tamponnée au phosphate (PBS) et en ajouter 450 l dans chaque puits d’un bordereau de couverture de 4 puits bien chambré (#1,5). Incuber la glissière pendant 15 min à 37 oC et 5 % de CO2. Rincer asynchronement les cellules HeLa en croissance asynchrone avec la saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco et incuber avec la trypsine-EDTA (0,05 % : 0,02 %; w:v) pendant 5 min à 37 oC….

Representative Results

Suivant le protocole donné décrit dans la figure 1A,le plasmide pEB3-tdTomato a été exprimé transitoirement dans les cellules De HeLa en croissance asynchrone. Les cellules ont été synchronisées 48 h après la transfection à proméaphase par le traitement DME (Figure 1B). Cette étape a permis de s’assurer que la mesure de la dynamique mT était toujours effectuée à la même phase du cycle cellulaire. Les films en time-lapse ont été traités et anal…

Discussion

Ici, nous décrivons une modification d’une méthode établie pour la première fois par Ertych et al.,⁴⁴. Avec plusieurs autres modifications, nous combinons cette technique d’analyse de dynamique de MT avec l’imagerie confocale de disque de rotation double. L’utilisation du disque à double filature améliore la résolution des MT en croissance tout en réduisant la phototoxicité³⁶. Nous réduisons davantage les dommages causés par le photoblanchiment et la lumière las…

Materials

Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software