عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغين من جلد البطن وتوليد مستحث المستحثة باستخدام أسلوب غير دمج

Summary

تتطلب أعاده برمجه الخلايا إدخال الجينات الرئيسية ، التي تنظم وتحافظ علي حاله الخلايا المستحثة. البروتوكول الموصوف يمكن تشكيل الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) مستعمرات من الليفية الجلدية البشرية دون أساليب الفيروسية/دمج ولكن باستخدام RNAs غير المعدلة (نانومتر-RNAs) جنبا إلى جنب مع عوامل التهرب المناعي الحد من أليات الدفاع الخلوي.

Abstract

ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) ، حتى الآن ، مصدرا واعدا للخلايا المستحثة لأداره الامراض غير القابلة للعلاج حاليا ، ولأعاده تشكيل الانسجه المصابة وتجديدها ، ولتطوير ادويه جديده. علي الرغم من جميع المزايا المتعلقة باستخدام iPSCs ، مثل انخفاض خطر الرفض ، والقضايا الاخلاقيه التي قللت ، وامكانيه الحصول عليها من كل من المرضي الصغار والكبار دون اي فرق في امكانيه أعاده برمجتها ، ومشاكل للتغلب علي لا تزال عديده. في الواقع ، يمكن أعاده برمجه الخلايا التي أجريت مع فيروسات الفيروسية ودمج تسبب العدوى وإدخال الجينات المطلوبة يمكن ان تحفز عدم الاستقرار الجينوم من الخلية المتلقية ، مما يعوق استخدامها في العيادة. علي وجه الخصوص ، هناك العديد من المخاوف بشان استخدام الجينات c-Myc ، والمعروفة من عده دراسات لنشاطها حفز الطفرة. وقد برزت الخلايا الليفية كالسكان الخلية مناسبه لأعاده برمجه الخلوية لأنها سهله لعزل والثقافة ويتم حصادها بواسطة خزعة الجلد الطفيفة الغازية لكمه. البروتوكول الموصوف هنا يوفر وصف مفصل خطوه بخطوه للاجراء بأكمله ، من معالجه العينة للحصول علي ثقافات الخلايا ، واختيار الكواشف واللوازم ، والتنظيف والاعداد ، إلى أعاده برمجه الخلية بواسطة وسائل تجاريه مجموعه أعاده البرمجة المستندة إلى RNAs (NM-RNAs) غير المعدلة. مجموعه أعاده برمجه المختار يسمح لأعاده برمجه فعاله من الخلايا الليفية الجلدية البشرية إلى iPSCs والمستعمرات الصغيرة يمكن ان ينظر اليها في وقت مبكر 24 ح بعد الانتقال الأول ، حتى مع التعديلات مع الاحترام لورقه البيانات القياسية. الاجراء أعاده برمجه المستخدمة في هذا البروتوكول يوفر ميزه أعاده برمجه أمنه, دون مخاطر العدوى الناجمة عن الأساليب الفيروسية القائمة علي ناقلات, يقلل من أليات الدفاع الخلوية, ويسمح للجيل من iPSCs خاليه من xeno, جميع الميزات الهامه التي إلزاميه لمزيد من التطبيقات السريرية.

Introduction

وتمثل أعاده برمجه الخلايا تكنولوجيا جديده لتحويل كل خليه جسديه من الجسم إلى خليه جذعيه مستحثه ، تعرف باسم iPSC¹. وقد تغلبت امكانيه أعاده برمجه خليه جسديه بالغه إلى دوله مستحثه وغير متمايزة علي الحدود التي يفرضها الفقراء علي التوافر والمسائل الاخلاقيه المتصلة باستخدام الخلايا المستحثة ، والتي كانت في السابق^{حيد عنه فقط}من الاجنه البشرية (الخلايا الجذعية الجنينية أو^ESC). في 2006 ، اجري كازوتوشي تاكاهاشي وشينيا ياماناكا دراسة رائده لتحقيق أول تحويل للخلايا الجسدية البالغة من الجلد إلى خلايا مستحثه باضافه أربعه جينات محدده بشكل مصطنع (Oct4 ، Sox2 ، Klf4 ، c-Myc)⁵. وبعد عام ، ادي العمل الذي اجري في مختبر طومسون إلى أعاده برمجه ناجحه للخلايا الجسدية في iPSCs عن طريق توصيل مزيج مختلف من أربعه جينات (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

تقدم iPSCs عددا من الفرص للعلماء والباحثين من مختلف المجالات ، مثل الطب التجديدي وعلم الصيدلة ، كونها منصة ممتازة لدراسة وعلاج الامراض المختلفة جنبا إلى جانب انعكاس التنميط الجيني لخصائص المريض التي تستمد منها. استخدام iPSCs يوفر العديد من المزايا بما في ذلك: انخفاض خطر الاستجابة المناعية بسبب أصل ذاتي تماما من الخلايا. امكانيه إنشاء مكتبه خليه ، أداه هامه للتنبؤ بالاستجابة للعقاقير الجديدة وأثارها الجانبية ، لأنها قادره علي التجديد الذاتي باستمرار وتوليد أنواع مختلفه من الخلايا ؛ والفرصة لوضع نهج مخصص لأداره المخدرات^7،8،9.

تقنيات متنوعة معروفه في الوقت الحاضر ، للحث علي التعبير عن عوامل أعاده برمجه وانها مدرجه في فئتين رئيسيتين: الطرق غير الفيروسية والفيروسية القائمة علي ناقلات الامراض^{10،11،12،13}. وتشمل الطرق غير الفيروسية نقل mrna ، ميرنا العدوى/ترانسكشن ، الحاملة ، النواقل الصغيرة والبلازميدات الفرجين و exosomes^{10،11،12،13}. وتشمل الأساليب القائمة علي الفيروسية الفيروسات غير المدمجة ، مثل فيروس الغدة الدرقية ، وحمي سينداي والبروتينات ، ودمج الفيروسات مثل الفيروسات الرجعية و لينتيفيروس^{10،11،12،13}.

وفقا لعده دراسات ، لم يلاحظ اي اختلافات كبيره بين هذه الطرق من حيث فعاليه أعاده برمجه الخلية ، التالي ، فان اختيار الطريقة المناسبة يعتمد بدقه علي نوع الخلية المستخدمة وعلي التطبيقات اللاحقة من ipscs التي تم الحصول عليها^14،15. جميع الطرق المذكورة تظهر مساوئ, علي سبيل المثال, فيروس سينداي فعاله علي جميع أنواع الخلايا, ولكن يتطلب الكثير من الممرات للحصول علي iPSCs; أعاده برمجه من قبل الابيسمات ممتازة لخلايا الدم ولكن يحتاج إلى تعديل ظروف الثقافة القياسية للخلايا الليفية. يمكن ان تمثل طريقه الدخول بديلا جذابا ولكن الدراسات في الخلايا البشرية لا تزال محدوده وضعيفه^{10،11،12،13}. التماثيل هي الحويصلات النانويه يفرز فسيولوجيا في جميع سوائل الجسم عن طريق الخلايا. ووفقا للدراسات الاخيره ، فهي مسؤوله عن الاتصالات بين الخلايا ويمكن ان يكون لها دور في العمليات البيولوجية الهامه ، مثل تكاثر الخلايا والهجرة والتمايز. Exosomes يمكن نقل ونقل mRNA وميرنا إلى الخلايا المتلقية مع اليه طبيعيه تماما ، كما انها تشترك في تكوين نفس الغشاء الخلوي¹⁶. ولذلك ، exosomes هي تقنيه جيل جديد واعده لأعاده برمجه ، ولكن قدرتها علي أعاده برمجه الخلايا الجسدية من محتواها لا يزال قيد التحقيق. تستخدم الأساليب القائمة علي النواقل الفيروسية الفيروسات المعدلة من أجل نقل الجينات أعاده برمجه إلى الخلايا المتلقية. هذا الأسلوب, علي الرغم من كفاءه عاليه من أعاده برمجه, لا تعتبر أمنه, كما ان دمج الفيروس داخل الخلية يمكن ان تكون مسؤوله عن العدوى, التراتومه وعدم الاستقرار الجينوم¹⁷.

البروتوكول التالي لتوليد مستعمرات iPSCs يجمع بين الكوكتيل في ياماناكا وأعاده برمجه طومسون ويستند علي استخدام طريقه تتطلب نانومتر-RNAs وعوامل التهرب المناعي مع امكانيه تنفيذ ذلك في ظروف خاليه من xeno. الأساس المنطقي وراء استخدام هذه الطريقة هو لنشر ، داخل المجتمع العلمي ، بروتوكول السماح لأعاده برمجه سريعة وبسيطه وفعاله للغاية من الخلايا الليفية البشرية الكبار من جلد البطن إلى iPSCs¹⁸.

نقاط القوه في الطريقة المقترحة هي ، في الواقع ، سهوله الأداء والوقت القصير اللازم للحصول علي iPSCs. وعلاوة علي ذلك ، فان الطريقة تتجنب أليات الدفاع الخلوي واستخدام النواقل الفيروسية ، المسؤولة عن القضايا ذات الصلة.

وفيما يتعلق بالبروتوكول الموحد ، أجريت التعديلات التالية: (1) تمت مزامنة متموج الخلايا الليفية في مرور 4 من خلال وضع في المصل 0.1 ٪ ل 48 h قبل التريسينزيشن ؛ (2) تم تعديل الكثافة الخلوية للثقافة وحجم الكواشف للاستخدام علي لوحه متعددة الآبار 24 جيدا بدلا من لوحه 6-حسنا ؛ (3) تم تنفيذ تجربه أعاده برمجه باستخدام حاضنه 5 ٪ CO₂ بدلا من حاضنه مع الغلاف الجوي (21 ٪ o₂) أو نقص الأكسجين (5 ٪ س₂) الشروط.

Protocol

تم جمع العينات من الانسجه البشرية وفقا لإعلان هلسنكي في حين مراقبه مستشفي جامعه فيديريكو الثاني المبادئ التوجيهية. وقدم جميع المرضي المشاركين في هذه الدراسة موافقه خطيه. 1. اعداد اللوازم والاعلام الثقافي تنظيف والاوتوكلاف واحد زوج كبير من مقص الجراحية ، ومجموعتين من ?…

Representative Results

وكان الهدف من هذا البروتوكول هو أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية المعزولة عن جلد البطن باستخدام طريقه البرمجة غير المدمجة التي تعتمد علي NM-RNAs للحث علي التعبير عن عوامل محدده. لتحقيق هذا الهدف ، تم عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية من عينات الجلد من المرضي الذين يخضعون لجراحه شد البط?…

Discussion

ipscs الناشئة بسرعة كمرشح الخلية الواعدة للتطبيقات الطب التجديدي وكاداه مفيده للغاية لنمذجة الامراض واختبار المخدرات^3,8. يصف البروتوكول المعروض هنا توليد iPSCs البشرية من عينه لها حجم خزعة الجلد لكمه مع اجراء بسيط وفعال لا يتطلب اي معدات محدده أو خبره سابقه مع أ…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles