Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Summary

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA’lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Abstract

İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) bugüne kadar, şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların yönetimi için pluripotent hücrelerin umut verici bir kaynak olarak kabul edilebilir, yaralı dokuların reconstitution ve rejenerasyon ve yeni ilaçların geliştirilmesi için. Düşük ret riski, azalan etik sorunlar ve yeniden programlama potansiyellerinde herhangi bir fark olmaksızın hem genç hem de yaşlı hastalardan bunları elde etme imkanı gibi iPSC’lerin kullanımına ilişkin tüm avantajlara rağmen, üstesinden gelinmesi gereken sorunlar hala çoktur. Aslında, viral ve entegre virüsler ile yapılan hücre yeniden programlama enfeksiyonlara neden olabilir ve gerekli genlerin giriş alıcı hücrenin bir genomik istikrarsızlık neden olabilir, klinikte kullanımını bozan. Özellikle, c-Myc geninin kullanımı hakkında birçok endişe vardır, mutasyona neden olan aktivitesi için çeşitli çalışmalardan iyi bilinmektedir. Fibroblastlar izole etmek ve kültür kolay ve minimal invaziv deri yumruk biyopsisi ile hasat olarak hücresel yeniden programlama için uygun hücre popülasyonu olarak ortaya çıkmıştır. Burada açıklanan protokol, numune işlemeden hücre kültürleri elde etmeye, reaktif ve malzeme seçimine, temizlik ve hazırlamaya, ticari bir yöntemle hücre yeniden programlamasına kadar tüm prosedürün ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sağlar. değiştirilmemiş RNA’lar (NM-RNA)tabanlı yeniden programlama kiti. Seçilen yeniden programlama kiti, insan dermal fibroblastının iPSC’lere etkin bir şekilde yeniden programlanmasına olanak sağlar ve küçük koloniler, standart veri sayfasına ilişkin değişikliklerle bile ilk transfeksiyondan sonra 24 saat kadar erken görülebilir. Bu protokolde kullanılan yeniden programlama prosedürü, viral vektör tabanlı yöntemlerin neden olduğu enfeksiyon riski olmadan güvenli bir yeniden programlama avantajı sunar, hücresel savunma mekanizmalarını azaltır ve xeno-free iPSCs üretimine izin verir, tüm daha fazla klinik uygulamalar için zorunlu olan kritik özellikler.

Introduction

Hücre yeniden programlama iPSC¹olarak bilinen bir pluripotent kök hücre, vücudun her somatik hücre dönüştürmek için yeni bir teknoloji temsil eder. Bir pluripotent ve farklılaşmamış devlet geri yetişkin bir somatik hücre yeniden programlama imkanı pluripotent hücrelerin kullanımı ile ilgili kötü durumu ve etik sorunlar tarafından dayatılan sınırları aşmak, daha önce sadece insan embriyolarından elde edilebilir (embriyonik kök hücreler veya ESC)^2,3,4. 2006 yılında, Kazutoshi Takahashi ve Shinya Yamanaka yapay dört özel genler (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵ekleyerek pluripotent hücrelere deriden yetişkin somatik hücrelerin ilk dönüşüm elde öncü bir çalışma yürüttü . Bir yıl sonra, Thomson laboratuvarında yapılan çalışmalar dört gen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶farklı bir kombinasyonu transdüksiyon tarafından iPSCs içine somatik hücrelerin başarılı yeniden programlama yol açtı .

iPSC’ler, elde ettikleri hastanın özelliklerinin genotyolojik bir yansıması ile birlikte farklı hastalıkları incelemek ve tedavi etmek için mükemmel bir platform olan, rejeneratif tıp ve farmakoloji gibi farklı alanlardaki bilim adamları ve araştırmacılariçin bir dizi fırsat sunar. iPSCs kullanımı dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar: hücrelerin tamamen otolog kökenli nedeniyle bağışıklık yanıtı için azaltılmış risk; sürekli olarak kendini yenileyebildikleri ve farklı hücre tipleri üretebildikleri için, yeni ilaçlara ve yan etkilerine tepkiyi tahmin etmek için önemli bir araç olan hücre kitaplığı oluşturma olasılığı; ve ilaç yönetimi için özelleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmek için şans^7,8,9.

Çeşitli teknikler şu anda, yeniden programlama faktörlerinin ifade ikna etmek için bilinen ve iki ana kategoride yer almaktadır: olmayan viral ve viral vektör tabanlı yöntemler^10,11,12,13. Viral olmayan yöntemler mRNA transfeksiyon, miRNA enfeksiyon / transfeksiyon, PiggyBac, minicircle vektörler ve epizomal plazmidler ve ekzozomlar^10,11,12,13içerir. Viral tabanlı yöntemler, Adenovirüs, Sendai virüs ve proteinler gibi entegre olmayan virüsler ve Retrovirus ve Lentivirus^10,11,12,13gibi entegre virüsler içerir.

Çeşitli çalışmalara göre, hücre yeniden programlama etkinliği açısından bu yöntemler arasında önemli bir fark fark edilmiştir, dolayısıyla, uygun yöntemseçimi kesinlikle kullanılan hücre tipine bağlıdır ve alınan iPSCs sonraki uygulamalara bağlıdır^14,15. Söz konusu tüm yöntemler dezavantajları göstermek, örneğin, Sendai virüs tüm hücre türleri üzerinde etkilidir, ancak iPSCs elde etmek için pasajlar bir sürü gerektirir; epizomlar tarafından yeniden programlama kan hücreleri için mükemmel ama fibroblastlar için standart kültür koşullarının değiştirilmesi gerekiyor; PiggyBac yöntemi çekici bir alternatif temsil edebilir ama insan hücrelerinde çalışmalar hala sınırlı ve zayıf^10,11,12,13. Ekzozomlar fizyolojik olarak tüm vücut sıvılarına hücreler tarafından salgılanan nano-veziküllerdir. Son çalışmalara göre, hücreler arası iletişimden sorumludurlar ve hücre çoğalması, göç ve farklılaşma gibi önemli biyolojik süreçlerde rol oynarlar. Ekzozomlar, hücre zarının aynı bileşimini paylaştıkları için mRNA ve miRNA’yı tamamen doğal bir mekanizmaya sahip alıcı hücrelere taşıyabilir ve aktarabilirler^16. Bu nedenle, ekzozomlar yeniden programlama için umut verici bir yeni nesil tekniktir, ancak somatik hücreleri içeriklerine göre yeniden programlama potansiyelleri hala araştırılmaktadır. Viral vektörtabanlı yöntemler, yeniden programlama genlerini alıcı hücrelere iletmek için değiştirilmiş virüsleri kullanır. Bu teknik, yeniden programlama yüksek verimliliğe rağmen, güvenli olarak kabul edilmez, hücre içinde virüsün entegrasyonu enfeksiyon sorumlu olabilir gibi, teratomlar ve genomik instabilite¹⁷.

IPSC kolonileri oluşturmak için aşağıdaki protokol Yamanaka ve Thompson’S yeniden programlama kokteyl birleştirir ve xeno-free koşullarda gerçekleştirmek için imkanı ile NM-RNA ve bağışıklık kaçırma faktörleri gerektiren bir yöntemin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntemin kullanımıarkasındaki mantığı yaymak için, bilimsel topluluk içinde, bir protokol iPSCs içine karın deriden yetişkin insan fibroblastlar hızlı, basit ve son derece etkili bir yeniden programlama sağlayan¹⁸.

Önerilen yöntemin güçlü yönleri, aslında, performans kolaylığı ve iPSCs elde etmek için gerekli kısa süre vardır. Ayrıca, yöntem hücresel savunma mekanizmaları ve viral vektörlerin kullanımını önler, ilgili konulardan sorumlu.

Standart protokole göre aşağıdaki değişiklikler yapılmıştır: (1) Konfluent fibroblastlar 48 saat boyunca %0.1 serum yerleştirilerek 4 8 no’lu paragrafta senkronize edilmiştir; (2) Kültür için hücresel yoğunluk ve reaktiflerin hacmi 6 kuyulu plaka yerine 24 kuyulu çok kuyulu bir plaka üzerinde kullanılmak üzere ayarlandı; (3) Yeniden programlama deneyi atmosferik (%21 O 2 ) veya hipoksik (%5 O₂₎koşullarına sahip birkuvöz yerine %5 CO₂ kuluçka makinesi kullanılarak gerçekleştirildi.

Protocol

İnsan dokusundan alınan örnekler Helsinki Bildirgesi’ne göre üniversite hastanesi Federico II yönergelerine uyulurken toplanmıştır. Bu çalışmaya katılan tüm hastalara yazılı izin verildi. 1. Malzeme ve Kültür Medyasının Hazırlanması Temiz ve otoklav cerrahi makas büyük bir çift, ince forceps iki set, mikrodissecting makas iki çift, 1 L steril şişe, 500 mL steril şişe, ve 250 mL steril şişe. 100 mm plaka, 60 mm plaka, 35 mm plaka, tek kullanı…

Representative Results

Protokolün amacı, abdominal deriden izole edilen dermal fibroblastların nm-rna’lara dayalı entegre olmayan yeniden programlama yöntemi ile belirli faktörlerin ekspresyonunu tetiklemek tir. Bu amaca ulaşmak için, insan dermal fibroblastlar mide tuck cerrahisi geçiren hastaların deri örneklerinden izole edildi ve iPSCs Oct4 tanıtArak oluşturuldu, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 yeniden programlama faktörleri ve E3, K3, B18 bağışıklık kaçırma faktörleri ticari kullanıma hazır yeniden programlama kiti …

Discussion

iPSCs hızla rejeneratif tıp uygulamaları için en umut verici hücre adayı olarak ortaya çıkmaktadır ve hastalık modelleme ve ilaç testi için son derece yararlı bir araç olarak^3,8. Burada sunulan protokol, herhangi bir özel ekipman veya yeniden programlama teknolojisi ile önceki deneyim gerektirmeyen basit ve verimli bir prosedür ile bir deri yumruk biyopsisi boyutuna sahip bir örnek insan iPSCs nesil açıklar.

Kaplama…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles