تحليل الورم وتوزيع الأنسجة من مستضد الهدف الأجسام المضادة العلاجية محددة
Summary
هنا نقدم بروتوكول لدراسة في توطين الجسم الحي للأجسام المضادة في الفئران نماذج xenograft الورم.
Abstract
الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي الأدوية متعددة الوظائف ذات الصلة العالية التي تعمل من خلال آليات مستقلة متغيرة للقضاء على الخلايا السرطانية. على مدى العقود القليلة الماضية، برز مجال conjugates المضادة للأدوية، والأجسام المضادة للبيض، مستقبلات مستضدات الشيميك (CAR) والعلاج المناعي للسرطان كمنطقة واعدة للغاية من التحقيقات الأساسية والعلاجية. مع العديد من التجارب البشرية الناجحة التي تستهدف مستقبلات نقاط التفتيش المناعية وخلايا CAR-T في سرطان الدم وسرطان الجلد بوتيرة اختراقية ، فهي أوقات مثيرة للغاية للعلاجات الأورام المستمدة من الاختلافات في هندسة الأجسام المضادة. للأسف, وقد ثبت أيضا أن أعدادا كبيرة من الأجسام المضادة والعلاجات CAR على أساس مخيبة للآمال في التجارب البشرية من السرطانات الصلبة بسبب محدودية توافر الخلايا المناعية في السرير الورم. الأهم من ذلك، التوزيع غير محدد للأجسام المضادة العلاجية في الأنسجة غير الأورام تسهم أيضا في عدم وجود فعالية سريرية، والسمية المرتبطة بها والفشل السريري. كما تعتمد الترجمة المؤمنة للدراسات قبل السريرية في مسارات السريرية البشرية للغاية على الفئران الورم xenograft فعالية ودراسات السلامة، وهنا نسلط الضوء على طريقة لاختبار الورم وتوزيع الأنسجة العامة للأجسام المضادة العلاجية. ويتحقق ذلك عن طريق وضع العلامات على الأجسام المضادة المنقاة البروتين A مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء بالقرب تليها التصوير الحي للفئران الحاملة للورم.
Introduction
وافقت ادارة الاغذية والعقاقير أول الأجسام المضادة أحادية النسيلة تستهدف CD3 (OKT3، Muromonab) في عام 19861،2. منذ ذلك الحين على مدى السنوات العشرين القادمة ، كان هناك انفجار سريع في مجال هندسة الأجسام المضادة بسبب النجاح الساحق للأجسام المضادة ضد مثبطات نقاط التفتيشالمناعية 3. بجانب التنشيط غير المباشر للجهاز المناعي ، يتم تهدف الأجسام المضادة إلى الإبلاغ مباشرة عن الخلايا السرطانية لإشراك الخلايا المناعية على وجه التحديد ، وإثارة السمية الخلوية عن طريق ناهض مستقبلات الموت ، وعرقلة إشارات بقاء الخلايا السرطانية ، وعرقلة تولد الأوعية (نمو الأوعية الدموية) ، وتقييد منظمي نقاط التفتيش المناعية ، وتقديم النظائر المشعة ، والعقاقير العلاجية الكيميائية وsrna كعوامل مترافقة2. بالإضافة إلى ذلك ، دراسة شظايا متغير سلسلة واحدة (scFv) من الأجسام المضادة المختلفة على سطح الخلايا التائية المستمدة من المريض وخلايا NK (CAR-T و CAR-NK) هي منطقة سريعة النمو من التحقيقات السريرية للعلاجات القائمة على الخلايا4.
التقارب فائقة عالية من الأدوية القائمة على الأجسام المضادة التي توفر الانتقائية لضداد التعبير عن الخلايا السرطانية يجعلها وكيلا جذابا. وبالمثل، فإن الولادة المستهدفة واستبقاء الورم في الجسم المضاد العلاجي (أو الدواء الكيميائي) هو المفتاح لتحقيق التوازن بين الفعالية على السمية. لذلك ، يتم استغلال عدد كبير من استراتيجيات الهندسة البروتينية التي تشمل ولكن لا تقتصر على5 والأجسام المضادة ثلاثيةالمحددة 6 لتعزيز كبير في الاحتباس الأمثل للورم من خلال الوريد (IV) حقن العلاجات5،7. هنا، نحن وصف طريقة بسيطة القائمة على الفلوريس لمعالجة الورم والأنسجة توزيع الأجسام المضادة المضادة للسرطان المحتملة الفعالية.
لأن الأنسجة الحيوانية تمتلك لصناعة السيارات الفلورية عندما متحمس في الطيف المرئي، وصفت في البداية الأجسام المضادة مع صبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة (على سبيل المثال، IRDye 800CW). للحصول على براهين من التحقيقات مفهوم, لقد حققنا استخدام مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) التي تستهدف الأجسام المضادة تسمى farletuzumab ومشتقة لها دعا مرساة Bispecific المنشط Cytotoxicity (BaCa)7 الأجسام المضادة التي تستهدف CO-FOLR1 ومستقبلات الموت-5 (DR5)8 في جسم مضاد واحد المؤتلف. FOLR1 هو مستقبلات مستهدفة واضحة ومحددة في المبيض والخلايا السرطانية TNBC، xenografts الورم وأورام المريض9. وتجدر الإشارة إلى أن هناك جهود متعددة لاستغلال سريريا FOLR1 باستخدام النهج القائمة على الأجسام المضادة لإشراك الخلايا المناعية والمقويات المخدرات المضادة (ADC) لسرطانات المبيض والثدي10،11.
في هذه الورقة الأساليب، ونحن استنساخ، وأعرب عن وتنقية السريرية المضادة لل FOLR1 (فارلتوزوماب) جنبا إلى جنب مع غيرها من الأجسام المضادة للسيطرة باستخدام نظام التعبير CHO. تم استخدام IgG1 isotype والأجسام المضادة للحماقة السريرية mucin-16 تسمى abagovomab12 كضوابط سلبية. بعد تنقية البروتين A، وصفت الأجسام المضادة المشار إليها مع IRDye 800CW وكانت تدار في الوريد الذيل للفئران عارية إما تحمل xenografts أو Xenografts الورم المبيض أو متحولة بشكل ثابت الإنسان FOLR1 التعبير عن سرطان القولون مورين xenografts. تم تتبع توطين الأجسام المضادة عن طريق التصوير الحي باستخدام طيف التصوير الحي في نقاط زمنية مختلفة متعددة7. ولا تتطلب هذه الطريقة أي تعديل وراثي أو حقن للركيزة لتمكين انبعاث الضوء وهي أسرع بكثير، وفعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويمكن تطبيق بروتوكول الاستنساخ والتعبير والتنقية ووضع العلامات العامة الوارد وصفها أدناه على أي جسم مضاد سريري وغير سريري إذا توفرت تسلسلات سلسلة ثقيلة وخفيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
انتقائية وأورام تسليم محددة من العلاجية المضادة للسرطان وكيل هو المفتاح لقياس فعالية وسلامة العلاج المستهدف معين13. هنا وصفنا نهجاً سريع وفعالاً للتحقيق في توزيع الأنسجة والورم التفصيلية للجسم المضاد لـ BaCa غير السريرية. النهج الموصوف ينطبق على أي جسم مضاد تم إنشاؤه حديثًا وي…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لمركز فرجينيا للسرطان مرفق التصوير الأساسي، مرفق التحليل الجزيئي الحيوي، مرفق المجهر المتقدم ومرفق فيفاريوم الأساسي للمساعدة. ج. تي-س هو محقق مهني مبكر في أكاديمية سرطان المبيض (OCA-DoD). وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة NCI / المعاهد القومية للصحة (R01CA233752) إلى J. T-S، الولايات المتحدة DoD برنامج أبحاث سرطان الثدي (BCRP) جائزة اختراق المستوى 1 إلى J. T-S (BC17097) والولايات المتحدة DOD برنامج أبحاث سرطان المبيض (OCRP) جائزة التمويل (OC180412) إلى J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
Referenzen
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
