標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析
Summary
ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin vivo局在化を研究するプロトコルを提示する。
Abstract
モノクローナル抗体は、がん細胞を排除する可変独立的な機構によって働く高親和性多機能薬である。過去数十年にわたり、抗体薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体(CAR)および癌免疫療法の分野は、基礎および治療学的調査の最も有望な分野として浮上してきました。白血病と黒色腫の免疫チェックポイント受容体とCAR-T細胞を画期的なペースで標的とした数多くの成功したヒト試験により、抗体工学のバリエーションに由来する腫瘍学的治療のための非常にエキサイティングな時間です。残念ながら、腫瘍床における免疫エフェクター細胞の利用が限られているため、抗体およびCARベースの治療の有意に多数のヒト試験においても失望することが証明されている。重要なことに、腫瘍以外の組織における治療抗体の非特異的分布は、臨床的有効性の欠如、関連する毒性および臨床的障害にも寄与する。ヒト臨床トレイルへの前臨床試験の忠実な翻訳は、マウス腫瘍異種移植片の有効性および安全性研究に大きく依存しているので、ここでは、治療抗体の腫瘍および一般的な組織分布を試験する方法を強調する。これは、タンパク質A精製抗体を近赤外蛍光色素で標識し、続いて腫瘍を有するマウスのライブイメージングを行うことによって達成される。
Introduction
FDAはCD3を標的とする最初のモノクローナル抗体を承認しました (OKT3, ムロモナブ)1,2.それ以来、次の20年間、免疫チェックポイント阻害剤3に対する抗体の圧倒的な成功により、抗体工学の分野で急速な爆発が起こった。免疫系の間接的な活性化に加えて、抗体は、免疫エフェクター細胞を正確に関与させるために癌細胞に直接フラグを付け、死の受容体アゴニストを介して細胞毒性を引き起こし、腫瘍細胞生存シグナル伝達をブロックし、血管新生(血管の成長)を妨害し、免疫チェックポイント調節因子を制約し、放射性同位体、化学療法薬およびsiRNAを共役剤として送達することを目的としている。また、患者由来T細胞やNK細胞(CAR-TおよびCAR-NK)の表面上の様々な抗体の単鎖可変フラグメント(scFv)を研究することは、細胞ベース療法のための臨床研究の急速な成長領域である4。
抗原発現腫瘍細胞への選択性を提供する抗体系薬物の超高親和性は、それを魅力的な薬剤にする。同様に、治療用抗体(または化学薬品)の標的送達および腫瘍保持は、毒性に対する有効性のバランスをとるための鍵である。したがって、二重特異性5および三特異的抗体6を含むがこれらに限定されない多数のタンパク質工学ベースの戦略が、静脈内に(IV)注入された治療薬のアビディティ最適化腫瘍保持を有意に増強するために利用されている。ここでは、潜在的に有効な抗癌抗体の腫瘍および組織分布に対処するための単純な蛍光ベースの方法について述べた。
動物組織は可視スペクトルで励起されると自己蛍光を有するため、抗体は当初、近赤外色素(例えばIRDye 800CW)で標識された。概念実証調査では、フォールレスツズマブと呼ばれる抗体を標的とする葉酸受容体α-1(FOLR1)とその誘導体である二重特異性アンカー細胞毒性活性化剤(BaCa)7抗体を1つの組換え抗体にCOR1および死受容体-5(DR5)8を共同標的とする抗体を用いた。FOLR1は、卵巣およびTNBC癌細胞、腫瘍異種移植片および患者腫瘍9において明確に定義された過剰発現標的受容体である。特に、抗体ベースのアプローチを用いてFOLR1を臨床的に利用して、卵巣癌および乳癌に対する免疫エフェクター細胞および抗体薬物コンジュゲート(ADC)を関与させる複数の取り組みがある。
本方法論文では、CHO発現系を用いた他の対照抗体とともに、臨床抗FOLR1(farletuzumab)をクローニング、発現、精製した。IgG1アイソタイプおよびアバゴボマブ12 と呼ばれる臨床抗イディオタイプムチン-16抗体を陰性対照として使用した。タンパク質A精製後、示された抗体はIRDye 800CWで標識され、卵巣腫瘍異種移植片または安定してトランスフェクトされたヒトFOLR1を発現するヒトFOLR1マウス大腸癌異種移植片のいずれかを有するヌードマウスの尾静脈に投与された。抗体の局在化は、複数の異なる時点点7でin vivoイメージングスペクトルを用いたライブイメージングによって追跡した。この方法は、発光を可能にするために基質の遺伝子組み換えまたは注入を必要とせず、大幅に迅速かつ費用対効果が高く、効率的である。以下に記載の一般的なクローニング、発現、精製および標識プロトコルは、重鎖および軽鎖配列が利用可能な場合、任意の臨床および非臨床抗体に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
抗癌治療薬の選択的および腫瘍組織特異的送達は、所定の標的治療13の有効性および安全性を測定する鍵である。ここでは、臨床、ファレツズマブおよび非臨床BaCa抗体の詳細な組織および腫瘍分布を調査するための迅速かつ効率的なアプローチについて述べた。記載されたアプローチは、新たに生成された抗体に適用可能であり、腫瘍/臓器の分布特性に臨床的に有効な抗体…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
バージニア大学がんセンターコアイメージング施設、生体分子分析施設、先端顕微鏡施設、コアビバリウム支援施設に感謝しています。J. T-Sは卵巣癌アカデミー(OCA-DoD)の初期のキャリア研究者です。この研究は、J.T-Sに対するNCI/NIH助成金(R01CA233752)、米国DoD乳がん研究プログラム(BCRP)の画期的なレベル1賞によってJ.T-S(BC17097)および米国DoD卵巣癌研究プログラム(OCRP)がJ-T-Sに授与されました。
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
Referenzen
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
