Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible
Summary
Ici nous présentons un protocole pour étudier la localisation in vivo des anticorps dans les modèles de xénogreffe de tumeur de souris.
Abstract
Les anticorps monoclonaux sont des médicaments multifonctionnels à haute affinité qui fonctionnent par des mécanismes indépendants variables pour éliminer les cellules cancéreuses. Au cours des dernières décennies, le domaine des anticorps conjugués, des anticorps bispécifiques, des récepteurs d’antigène chimérique (RCA) et de l’immunothérapie contre le cancer est devenu le domaine le plus prometteur des investigations fondamentales et thérapeutiques. Avec de nombreux essais humains réussis ciblant les récepteurs des points de contrôle immunitaires et les cellules CAR-T dans la leucémie et le mélanome à un rythme révolutionnaire, c’est une période très excitante pour les thérapeutiques oncologiques dérivées de variations de l’ingénierie des anticorps. Malheureusement, un nombre significativement élevé d’anticorps et de thérapies basées sur la RCA se sont également avérés décevants dans les essais humains des cancers solides en raison de la disponibilité limitée des cellules immunisées d’effecteur dans le lit de tumeur. Fait important, la distribution non spécifique d’anticorps thérapeutiques dans des tissus autres que les tumeurs contribue également au manque d’efficacité clinique, à la toxicité associée et à l’échec clinique. Comme la traduction fidèle des études précliniques dans les traînées cliniques humaines sont fortement comptées sur des souris tumeur xénogreffe efficacité et études d’innocuité, ici nous soulignons une méthode pour tester la tumeur et la distribution générale de tissu des anticorps thérapeutiques. Ceci est réalisé en étiquetant l’anticorps purifié de protéine-A avec le colorant fluorescent proche infrarouge suivi de l’imagerie vivante des souris porteuses de tumeur.
Introduction
Fda a approuvé le premier anticorps monoclonal ciblant CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Depuis lors, pendant les vingt prochaines années, il ya eu une explosion rapide dans le domaine de l’ingénierie des anticorps en raison du succès écrasant des anticorps contre les inhibiteurs du point decontrôle immunitaire 3. Outre l’activation indirecte du système immunitaire, les anticorps visent à signaler directement les cellules cancéreuses pour engager avec précision les cellules effectrices immunitaires, déclencher la cytotoxicité par l’intermédiaire de l’agoniste des récepteurs de la mort, bloquer la signalisation de survie des cellules tumorales, obstruer l’angiogenèse (croissance des vaisseaux sanguins), contraindre les régulateurs de contrôle immunitaires, délivrer des radioisotopes, des agents chimiothérapeutiques et de l’ARN comme agents conjugués2. En outre, l’étude des fragments variables à chaîne unique (scFv) de divers anticorps à la surface des cellules T dérivées du patient et des cellules NK (CAR-T et CAR-NK) est un domaine en croissance rapide des investigations cliniques pour les thérapies cellulaires4.
L’affinité ultra-élevée des médicaments à base d’anticorps qui fournit la sélectivité à l’antigène exprimant les cellules tumorales en fait un agent attrayant. De même, l’accouchement ciblé et la rétention tumorale d’un anticorps thérapeutique (ou d’un médicament chimique) est la clé pour équilibrer l’efficacité sur la toxicité. Par conséquent, un grand nombre de stratégies basées sur l’ingénierie protéique qui incluent mais ne sont pas limitées aux anticorps bispécifiques5 et tri-spécifiques6 sont exploitées pour augmenter sensiblement la conservation optimisée de tumeur d’avidité des thérapeutiques injectées par voie intraveineuse (IV)5,7. Ici, nous décrivons une méthode basée sur la fluorescence simple pour adresser la distribution de tumeur et de tissu des anticorps anticancéreux potentiellement efficaces.
Puisque les tissus animaux possèdent l’auto-fluorescence une fois excités dans le spectre visible, les anticorps ont été au commencement étiquetés avec le colorant infrarouge proche (par exemple, IRDye 800CW). Pour des preuves d’études de concept, nous avons utilisé le récepteur folique alpha-1 (FOLR1) ciblant l’anticorps appelé farletuzumab et son dérivé appelé activateur d’ancrage bispécifique Cytotoxicity (BaCa)7 qui co-cible FOLR1 et récepteur de la mort-5 (DR5)8 dans un anticorps recombinant. FOLR1 est un récepteur cible surexprimé bien défini dans les cellules cancéreuses ovariennes et TNBC, les xénogreffes tumorales et les tumeurs patientes9. Il y a notamment de multiples efforts pour exploiter cliniquement FOLR1 à l’aide d’approches à base d’anticorps pour engager les cellules effectrices immunitaires et les conjugués anticorps (ADC) pour les cancersde l’ovaire et du sein 10,11.
Dans cet article de méthodes, nous avons cloné, exprimé et purifié anti-FOLR1 clinique (farletuzumab) avec d’autres anticorps de contrôle utilisant le système d’expression de CHO. L’isotype IgG1 et un anticorps clinique anti-idiotype mucin-16 appelé abagovomab12 ont été utilisés comme témoins négatifs. Après purification de protéine-A, les anticorps indiqués ont été étiquetés avec IRDye 800CW et ont été administrés dans la veine de queue des souris nues portant des xénogreffes de tumeur ovarienne ou folr1 humain habilement transfected exprimant des xénogreffes de cancer du côlon murine. La localisation des anticorps a été suivie par imagerie en direct à l’aide du spectre d’imagerie in vivo à plusieurs momentsdifférents 7. Cette méthode ne nécessite aucune modification génétique ou injection du substrat pour permettre l’émission de lumière et est beaucoup plus rapide, rentable et efficace. Le protocole général de clonage, d’expression, de purification et d’étiquetage décrit ci-dessous peut être appliqué à n’importe quel anticorps clinique et nonclinique si des séquences de chaîne lourde et légère sont disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La livraison sélective et spécifique de tissu de tumeur de l’agent thérapeutique anticancéreux est la clé pour mesurer l’efficacité et l’innocuité d’une thérapie cibléedonnée 13. Ici nous avons décrit une approche rapide et efficace pour étudier la distribution détaillée de tissu et de tumeur du clinicien, du farletuzumab et d’un anticorps nonclinique de BaCa. L’approche décrite est applicable à n’importe quel anticorps nouvellement généré et peut être employée a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à l’Université de Virginie Cancer Center Centre Centre d’imagerie de base, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility et le Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S est un chercheur en début de carrière de l’Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Ces travaux ont été appuyés par la subvention de l’INFE/NIH (R01CA233752) à J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) breakthrough level-1 award to J. T-S (BC17097) et U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) funding award (OC180412) to J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
Referenzen
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
