Magnetische aanpassing van nalading in engineered heart tissues
Summary
Dit protocol biedt gedetailleerde methoden waarin de fabricage en implementatie van een op magneten gebaseerd naladingstuningplatform voor ontworpen hartweefsels wordt beschreven.
Abstract
Van afterload is bekend dat het de ontwikkeling van zowel fysiologische als pathologische harttoestanden stimuleert. Als zodanig kan het bestuderen van de resultaten van gewijzigde naladingstoestanden belangrijke inzichten opleveren in de mechanismen die deze kritieke processen controleren. Echter, een experimentele techniek voor het nauwkeurig finetunen van nalading in hartweefsel na verloop van tijd ontbreekt momenteel. Hier wordt een nieuw ontwikkelde techniek op basis van magneten beschreven voor het bereiken van deze controle in gemanipuleerde hartweefsels (EHT’s). Om magnetisch responsieve EHT’s (MR-EHT’s) te produceren, worden de weefsels gemonteerd op holle siliconenpalen, waarvan sommige kleine permanente magneten bevatten. Een tweede set permanente magneten is pers-fit in een acrylplaat zodanig dat ze zijn georiënteerd met dezelfde polariteit en zijn axiaal uitgelijnd met de post magneten. Om nalading aan te passen, wordt deze plaat van magneten vertaald naar (hogere nalading) of weg (lagere nalading) van de postmagneten met behulp van een piëzo-elektrisch stadium dat met een encoder wordt gepast. De motion control software die wordt gebruikt om de fase positionering aan te passen maakt de ontwikkeling van de gebruiker gedefinieerde nalading regimes, terwijl de encoder zorgt ervoor dat het stadium corrigeert voor eventuele inconsistenties in de locatie. Dit werk beschrijft de fabricage, kalibratie en implementatie van dit systeem om de ontwikkeling van soortgelijke platforms in andere laboratoria over de hele wereld mogelijk te maken. Representatieve resultaten van twee afzonderlijke experimenten zijn opgenomen om het bereik van verschillende studies die met dit systeem kunnen worden uitgevoerd, te illustreren.
Introduction
Nalading is de systolische belasting op de ventrikel nadat het is begonnen met het uitwerpen van bloed1. Tijdens de cardiale ontwikkeling is een geschikte nabelasting van cruciaal belang voor cardiomyocyte rijping2. Op volwassen leeftijd kunnen lage niveaus van ventriculaire nabelasting (bijvoorbeeld bij bedlegerige patiënten met een dwarslaesie op hoog niveau3 of in zeer speciale gevallen zoals spaceflight4)leiden tot hypotrofie van het hart. Omgekeerd kan hoge nabelasting leiden tot cardiale hypertrofie5. Terwijl cardiale hypertrofie bij duursporters of zwangere vrouwen wordt beschouwd als gunstig en fysiologisch, hypertrofie geassocieerd met langdurige arteriële hypertensie of ernstige aortaklep stenose is schadelijk omdat het vatbaar is voor hartritmestoornissen en hartfalen6. Hoewel de 5-jarige mortaliteit voor patiënten met hartfalen is gedaald van ~ 70% in de jaren 19806 tot 40-50%7 op dit moment, is er nog steeds een grote behoefte aan nieuwe therapeutische behandeling opties voor deze zeer heersende aandoening (momenteel 2,2% van de bevolking in de westerse wereld)8.
Om de moleculaire mechanismen van pathologische cardiale hypertrofie te onderzoeken en preventieve of therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekte te testen, zijn in vivo modellen van nalading ontwikkeld9,10,11,12. Hoewel deze modellen gunstige inzichten hebben geboden in de effecten van nabelasting op ventriculaire prestaties, staan ze geen fijne controle over de nabelastingsomvang toe. Als alternatief maken in vitro studies van nalading uitgevoerd op uitgesneden harten en spierpreparaten een fijnere controle over weefselbelasting mogelijk, maar deze modellen zijn niet bevorderlijk voor longitudinale studies13,14,15.
Om deze problemen op te lossen, ontwikkelden we een in vitro model van verhoogde nabelasting in ontworpen hartweefsels (EHT’s)16,17. Dit model is een 3-dimensionaal kweekformaat voor rattenhartcellen ingebed in een fibrinematrix die tussen flexibele holle siliconenpalen wordt opgehangen. Deze weefsels slaan spontaan (tegen de weerstand van de siliconenpalen) en voeren auxotonic werk uit. We hebben de nalading die in eerdere experimenten op EHT’s werd aangebracht met een factor 12 verhoogd door een week lang stijve metalen beugels in de holle siliconenpalen in te brengen. Dit leidde tot een veelheid aan veranderingen, kenmerkend voor pathologische cardiale hypertrofie18,19,20: cardiomyocyte hypertrofie, gedeeltelijke necroptose, een afname van de contractiele kracht, de aantasting van weefselontspanning, reactivering van het foetale genprogramma, een metabole verschuiving van vetzuuroxidatie naar anaerobe glycolyse en een toename van fibrose. Hoewel deze procedure met succes is toegepast in verschillende studies17,21,22, het heeft een aantal nadelen. Er zijn slechts twee toestanden, laag of zeer hoog (12-voudig) nalading, en de procedure vereist handmatige behandeling van de EHT’s, wat de tijdelijke flexibiliteit beperkt en het risico van besmetting vormt.
Onlangs, Leonard et al. gebruikt een soortgelijke techniek te moduleren nalading in EHTs gekweekt op siliconen posten23. Beugels van verschillende lengtes werden geplaatst rond de buitenkant van de palen om hun buigen de beweging te beperken. De auteurs van deze studie rapporteerden dat een bijzondere kleine tot gemiddelde toename van de belasting de ontwikkeling en rijping van menselijke iPS-afgeleide EHT’s verbeterde, terwijl hogere belastingen resulteerden in een pathologische toestand. Echter, vergelijkbaar met ons eigen systeem, deze techniek alleen zorgt voor enkelvoud verhogingen van de nabelasting, waarvan de omvang wordt gedicteerd door de lengte van de beugels. Als zodanig, fijne wijzigingen in nalading, wijzigingen in nabelasting na verloop van tijd, en nauwkeurige lading regimes zijn niet mogelijk met deze technieken.
Hier bieden we het protocol voor een systeem dat kan worden gebruikt om post-weerstand te moduleren, dat wil zeggen, nalading van EHTs magnetisch24. Dit platform vergemakkelijkt de fine-tuning van afterload, maakt door de gebruiker gedefinieerde naladingsregimes mogelijk en zorgt voor EHT-steriliteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierbeschreven protocol beschrijft een nieuwe techniek voor het magnetisch veranderen van nabelasting in gemanipuleerde hartweefsels. Deze techniek is gebaseerd op het gebruik van een piëzo-elektrisch stadium om een plaat van sterke magneten te vertalen naar en uit de buurt van magnetisch responsieve rekken van siliconen palen. Hoe dichter de twee sets magneten, hoe sterker de nalading ervaren door de EHTs gekweekt op hen.
Er zijn verschillende stappen die van cruciaal belang zijn voor de…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Jutta Starbatty voor haar steun in weefselkweekwerk, Axel Kirchhof voor fotografie, Alice Casagrande Cesconetto voor het bewerken van werk, en een speciale dank aan Bülent Aksehirlioglu voor technische ondersteuning bij de ontwikkeling van dit apparaat. B.B. werd ondersteund door een DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. door een Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant en M.N.H. door fondsen van de DZHK.
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
Referenzen
- Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. . Braunwald’s Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).
- McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
- de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
- Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
- Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
- Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29 (2015).
- Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
- Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
- Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
- Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).
- Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).
- Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
- Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
- Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
- Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
- Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
- Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).
- Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).
- Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
- Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
- Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).
