이 프로토콜은 엔지니어링 된 심장 조직을위한 자기 기반 애프터 로드 튜닝 플랫폼의 제조 및 구현을 설명하는 자세한 방법을 제공합니다.
애프터로드는 생리학적 및 병리학적 심장 상태의 발달을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서 변경된 애프터로드 상태의 결과를 연구하면 이러한 중요한 프로세스를 제어하는 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 따라 심장 조직에 정밀 하 게 미세 조정 애프터 로드에 대 한 실험 기술 현재 부족. 여기에서, 엔지니어링된 심혼 조직 (EHTs)에 있는 이 통제를 달성하기 위한 새로 개발된 자기 기지를 둔 기술은 기술됩니다. 자기 반응 형 EHTs (MR-EHTs)를 생산하기 위해, 조직은 중공 실리콘 기둥에 장착되며, 그 중 일부는 작은 영구 자석을 포함합니다. 영구 자석의 두 번째 세트는 동일한 극성을 지향하고 포스트 자석과 축으로 정렬되도록 아크릴 플레이트에 프레스 핏입니다. 애프터로드를 조정하기 위해 이 자석 플레이트는 인코더가 장착된 압전 스테이지를 사용하여 포스트 자석에서 (더 높은 애프터로드) 또는 멀리(하부 애프터로드)로 변환됩니다. 스테이지 포지셔닝을 조정하는 데 사용되는 모션 제어 소프트웨어는 사용자 정의 애프터로드 요법을 개발하도록 허용하며 인코더는 스테이지가 해당 위치의 불일치를 보정하도록 보장합니다. 이 작업은 전 세계의 다른 실험실에서 유사한 플랫폼을 개발할 수 있도록 이 시스템의 제작, 교정 및 구현에 대해 설명합니다. 2개의 개별적인 실험에서 대표적인 결과는 이 시스템을 사용하여 수행될 수 있는 상이한 연구의 범위를 예시하기 위해 포함된다.
애프터로드는 혈액1을배출하기 시작한 후 심실의 수축기 하중입니다. 심장 발달 도중, 적당한 afterload는 심근세포 성숙을 위해 매우 중요합니다2. 성인기에서는, 심실 후부하의 낮은 수준 (예를 들면, 높은 수준의 척수 상해를 가진 침대에 누워 있는환자에서 3 또는 spaceflight4같이 아주 특별한 경우에) 심혼의 위축귀귀착될 수 있습니다. 반대로, 높은 후하중은 심장비대5로이어질 수 있습니다. 지구력 운동 선수 또는 임산부의 심장 비대는 유익하고 생리적인 것으로 간주되지만 장기 동맥 고혈압 또는 심한 대동맥 판막 협착과 관련된 비대는 심장 부정맥과 심부전을 유발하기 때문에 유해합니다6. 심부전 환자의 5년 사망률은 1980년대 6~70%에서6 현재 40~50%로 감소했지만, 여전히 이 매우 널리 퍼진 상태(현재 서구 세계 인구의 2.2%)에 대한 새로운 치료 치료 옵션에 대한 필요성이 매우크다.8.7
병리학적 심장 비대의 분자 기전을 조사하고 이 질병을 치료하기 위한 예방 또는 치료 전략을 테스트하기 위해, 생체 내 애프터로드 모델은99,10,,11,,12로개발되었다. 이 모델은 심실 성능에 대한 애프터로드의 영향에 대한 유익한 통찰력을 제공하지만, 애프터 로드 크기를 미세하게 제어 할 수 없습니다. 대안적으로, 절제된 심장 및 근육 제제에서 수행된 애프터로드의 시험관내 연구는 조직 로딩에 대한 보다 미세한 제어를 허용하지만, 이들 모델은 세로 연구에 도움이 되지 않는다13,,14,,15.
이러한 문제점을 극복하기 위해, 우리는 엔지니어링 된 심장 조직 (EHTs)16,,17에서상승 된 애프터 로드의 체외 모델을 개발했습니다. 이 모델은 유연한 중공 실리콘 기둥 사이에 현탁된 피브린 매트릭스에 내장된 쥐 심장 세포에 대한 3차원 배양 형식이다. 이 조직은 자발적으로 (실리콘 기둥의 저항에 대해) 치고 보조 작업을 수행합니다. 우리는 1 주일 동안 중공 실리콘 기둥에 단단한 금속 중괄호를 삽입하여 이전 실험에서 12의 비율로 EHT에 적용 된 애프터 로드를 증가시켰습니다. 이것은 병리학적인 심장 비대18,,19,,20의특징 : 심근 세포 비대, 부분 necroptosis, 수축력의 감소, 조직 이완의 손상, 태아 유전자 프로그램의 재활성화, 지방산 산화에서 혐기성 글리코 분해로의 대사 변화, 섬유증의 증가로 이어졌습니다. 이 절차는 여러 연구에서 성공적으로 채택되었지만17,,21,,22,몇 가지 단점이 있습니다. 애프터로드는 낮거나 매우 높은 두 가지 상태만 있으며 절차는 시간적 유연성을 제한하고 오염의 위험을 초래하는 EHT의 수동 처리가 필요합니다.
최근, 레너드 등은 실리콘포스트(23)에배양된 EHTs에서 애프터로드를 조절하기 위해 유사한 기술을 사용했다. 다양한 길이의 중괄호를 기둥 바깥쪽에 배치하여 굽힘 동작을 제한했습니다. 이 연구의 저자는 부하 강화 힘 개발 및 인간 iPS 파생 된 EHTs의 성숙에 있는 단수 작은 중간 증가 보고, 높은 하중 병 리 상태 결과 하는 동안. 그러나 우리 시스템과 마찬가지로 이 기법은 보조기의 길이에 따라 크기가 결정되는 애프터 로드의 단수 증가만 허용합니다. 따라서 이러한 기술로는 애프터로드의 미세 변경, 시간이 지남에 따라 애프터 로드의 수정 및 정확한 로딩 식이요법이 불가능합니다.
여기서, 우리는 후 저항, 즉, EHTs의 애프터로드를 자기적으로 조절하는 데 사용될 수 있는 시스템에 대한 프로토콜을제공한다.24. 이 플랫폼은 애프터로드의 미세 조정을 용이하게하고, 사용자 정의 애프터 로드 요법을 가능하게하며, EHT 멸균을 보장합니다.
본 명세서에 설명된 프로토콜은 엔지니어링된 심장 조직에서 자기적으로 애프터로드를 변경하는 새로운 기술을 설명합니다. 이 기술은 압전 스테이지를 사용하여 강한 자석 판을 실리콘 포스트의 자기 반응 랙에서 멀어지게 합니다. 자석의 두 세트가 가까울수록, 그 위에 배양된 EHTs가 경험한 애프터로드가 더 강해집니다.
이 시스템의 성공적인 생산 및 사용에 중요한 몇 가?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 조직 문화 작업에 그녀의 지원에 대한 Jutta Starbatty 감사, 사진에 대한 악셀 키르히호프, 편집 작업에 대한 앨리스 카사 그란데 세스코네토, 이 장치의 개발에 기술 지원을 위한 Bülent Aksehirlioglu에 특별한 감사. B.B.는 DZHK (독일 심혈관 연구 센터) 학자 그랜트, 휘태커 국제 박사 후 학자 그랜트 및 DZHK의 기금에 의해 M.L.R.에 의해 지원되었습니다.
Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |