Ajuste magnético da pós-carga em tecidos cardíacos projetados
Summary
Este protocolo fornece métodos detalhados descrevendo a fabricação e a implementação de uma plataforma de ajuste pós-carga baseada em magnéticos para tecidos cardíacos projetados.
Abstract
O pós-carga é conhecido por impulsionar o desenvolvimento de estados cardíacos fisiológicos e patológicos. Como tal, estudar os resultados de estados pós-carga alterados poderia produzir insights importantes sobre os mecanismos que controlam esses processos críticos. No entanto, uma técnica experimental para ajustar precisamente a pós-carga no tecido cardíaco ao longo do tempo está atualmente em falta. Aqui, uma técnica recém-desenvolvida baseada em magnéticos para alcançar esse controle em tecidos cardíacos projetados (EHTs) é descrita. Para produzir EHTs magneticamente responsivos (MR-EHTs), os tecidos são montados em postes de silicone oco, alguns dos quais contêm pequenos ímãs permanentes. Um segundo conjunto de ímãs permanentes é encaixe em uma placa de acrílico de tal forma que eles são orientados com a mesma polaridade e estão alinhados axialmente com os ímãs post. Para ajustar a pós-carga, esta placa de ímãs é traduzida para (pós-carga mais alta) ou para longe (pós-carga inferior) dos ímãs postais usando um estágio piezoelétrico equipado com um codificador. O software de controle de movimento usado para ajustar o posicionamento de palco permite o desenvolvimento de regimes de pós-carga definidos pelo usuário, enquanto o codificador garante que o estágio corrija qualquer inconsistência em sua localização. Este trabalho descreve a fabricação, calibração e implementação deste sistema para permitir o desenvolvimento de plataformas semelhantes em outros laboratórios ao redor do mundo. Resultados representativos de dois experimentos separados são incluídos para exemplificar a gama de diferentes estudos que podem ser realizados usando este sistema.
Introduction
Pós-carga é a carga sistólica no ventrículo depois de ter começado a ejetar sangue1. Durante o desenvolvimento cardíaco, uma pós-carga adequada é de importância crítica para a maturação de cardiomiócitos2. Na idade adulta, baixos níveis de pós-carga ventricular (por exemplo, em pacientes acamados com lesão medular de alto nível3 ou em casos muito especiais como o vôo espacial4) podem resultar em hipotrofia do coração. Por outro lado, a alta carga posterior pode levar à hipertrofia cardíaca5. Embora a hipertrofia cardíaca em atletas de resistência ou gestantes seja considerada benéfica e fisiológica, a hipertrofia associada à hipertensão arterial de longo prazo ou à estenose da válvula aórtica grave é prejudicial, pois predispõe uma a arritmias cardíacas e insuficiência cardíaca6. Embora a taxa de mortalidade de 5 anos para pacientes com insuficiência cardíaca tenha reduzido de ~70% na década de 19806 para 40-50%7 atualmente, ainda há uma grande necessidade de novas opções de tratamento terapêutico para esta condição altamente prevalente (atualmente 2,2% da população no mundo ocidental)8.
Para investigar os mecanismos moleculares da hipertrofia cardíaca patológica e testar estratégias preventivas ou terapêuticas para o tratamento dessa doença, foram desenvolvidos modelos in vivo de pós-carga9,,10,,11,12. Embora esses modelos tenham oferecido insights benéficos sobre os efeitos da pós-carga no desempenho ventricular, eles não permitem um controle fino sobre a magnitude pós-carga. Alternativamente, estudos in vitro de pós-carga realizados em corações excisados e preparações musculares permitem um controle mais fino sobre o carregamento de tecidos, mas estes modelos não são propícios a estudos longitudinares13,14,15.
Para superar essas questões, desenvolvemos um modelo in vitro de pós-carga elevada em tecidos cardíacos projetados (EHTs)16,17. Este modelo é um formato de cultura tridimensional para células cardíacas de ratos embutidas em uma matriz de fibrina suspensa entre postes flexíveis de silicone oco. Esses tecidos batem espontaneamente (contra a resistência dos postes de silicone) e realizam trabalhos auxotônicos. Aumentamos a pós-carga aplicada aos EHTs por um fator de 12 em experimentos anteriores pela inserção de aparelhos metálicos rígidos nos postes de silicone ocos por uma semana. Isso levou a uma infinidade de alterações, características da hipertrofia cardíaca patológica18,19,20: hipertrofia cardiomiocito, necroptose parcial, declínio da força contífica, o comprometimento do relaxamento tecidual, reativação do programa genético fetal, uma mudança metabólica da oxidação do ácido graxo para a glicólise anaeróbica, e um aumento da fibrose. Embora este procedimento tenha sido empregado com sucesso em vários estudos17,21,22, tem algumas desvantagens. Existem apenas dois estados, carga posterior baixa ou muito alta (12 vezes), e o procedimento requer o manuseio manual dos EHTs, o que limita sua flexibilidade temporal e representa o risco de contaminação.
Recentemente, Leonard et al. usaram uma técnica semelhante para modular a pós-carga em EHTs cultivados em postes de silicone23. Aparelhos de comprimentos variados foram colocados ao redor do lado de fora dos postes para restringir seu movimento de dobra. Os autores deste estudo relataram que um aumento singular de pequeno a médio aumento no desenvolvimento de força aumentada da carga e maturação de EHTs derivados do iPS humano, enquanto cargas mais altas resultaram em um estado patológico. No entanto, semelhante ao nosso próprio sistema, esta técnica só permite aumentos singulares na pós-carga, a magnitude da qual é ditada pelo comprimento das chaves. Como tal, alterações finas no pós-carga, modificações no pós-carregamento ao longo do tempo e regimes de carregamento precisos não são possíveis com essas técnicas.
Aqui, fornecemos o protocolo para um sistema que pode ser usado para modular a pós-resistência, ou seja, pós-carga de EHTs magneticamente24. Esta plataforma facilita o ajuste fino do pós-carga, permite regimes de pós-carga definidos pelo usuário e garante a esterilidade EHT.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito descreve uma nova técnica para alterar magneticamente pós-carga em tecidos cardíacos projetados. Esta técnica se baseia no uso de um estágio piezoelétrico para traduzir uma placa de ímãs fortes para e longe de racks magneticamente responsivos de postes de silicone. Quanto mais próximos os dois conjuntos de ímãs, mais forte a pós-carga experimentada pelos EHTs cultivados sobre eles.
Existem várias etapas que são fundamentais para o sucesso da produção e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Jutta Starbatty pelo apoio no trabalho de cultura de tecidos, Axel Kirchhof pela fotografia, Alice Casagrande Cesconetto pelo trabalho de edição, e um agradecimento especial a Bülent Aksehirlioglu pelo apoio técnico no desenvolvimento deste dispositivo. B.B. foi apoiado por um DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. por um Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant e M.N.H. por fundos do DZHK.
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
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