Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh))RNA Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA Stable
Summary
Nous fournissons un protocole pour abattre de façon stable les gènes codant les protéines de matrice extracellulaire (ECM) dans les myoblastes C2C12 à l’aide d’ARN à épingle sh. Ciblant ADAMTSL2 à titre d’exemple, nous décrivons les méthodes de validation de l’efficacité de knockdown sur l’ARNm, la protéine et le niveau cellulaire pendant le myoblaste C2C12 à la différenciation myotube.
Abstract
Les protéines de matrice extracellulaire (ECM) sont cruciales pour le développement des muscles squelettiques et l’homéostasie. Le renversement stable des gènes codant pour les protéines ECM dans les myoblastes C2C12 peut être appliqué pour étudier le rôle de ces protéines dans le développement des muscles squelettiques. Ici, nous décrivons un protocole pour épuiser la protéine d’ECM ADAMTSL2 comme exemple, utilisant l’ARN de petite épingle (sh) dans les cellules c2C12. Après transfection des plasmides de shRNA, les cellules stables ont été batch-sélectionnées utilisant la puromycine. Nous décrivons en outre le maintien de ces lignées cellulaires et l’analyse phénotypique par l’expression de l’ARNm, l’expression protéique et la différenciation C2C12. Les avantages de la méthode sont la génération relativement rapide de cellules stables de knockdown c2C12 et la différenciation fiable des cellules c2C12 en myotubes multinucléés lors de l’épuisement du sérum dans le milieu de culture cellulaire. La différenciation des cellules C2C12 peut être surveillée par microscopie lumineuse de champ et en mesurant les niveaux d’expression des gènes canoniques de marqueur, tels que MyoD, myogénine, ou chaîne lourde de myosine (MyHC) indiquant la progression de la différenciation de myoblast c2C12 dans les myotubes. Contrairement à l’élimination transitoire des gènes avec de l’ARN à petite interférence (si), les gènes qui sont exprimés plus tard au cours de la différenciation C2C12 ou pendant la maturation du myotube peuvent être ciblés plus efficacement en générant des cellules C2C12 qui expriment de façon stable shRNA. Les limites de la méthode sont une variabilité dans l’efficacité knockdown, en fonction de l’ARSs spécifique qui peut être surmontée en utilisant des stratégies de knockout gène basé sur CRISPR/Cas9, ainsi que les effets potentiels hors cible de l’ARSs qui devraient être considérés.
Introduction
Les protéines de matrice extracellulaire (ECM) fournissent le soutien structurel pour tous les tissus, la communication de cellules-cellules de médiation, et déterminent le destin de cellules. La formation et le remodelage dynamique de l’ECM sont donc essentiels pour maintenir l’homéostasie des tissus et des organes1,2. Les variantes pathologiques dans plusieurs gènes codant pour des protéines d’ECM donnent lieu à des désordres musculo-squelettiques avec des phénotypes s’étendant des dystrophies musculaires à la construction pseudomouscular3,4. Par exemple, les variantes pathogènes dans ADAMTSL2 causent la dysplasie géléophile extrêmement rare de désordre musculo-squelettique, qui présente avec la construction pseudomusculaire, c.-à-d., une augmentation apparente de la masse de muscle squelettique5. Avec les données d’expression génique chez la souris et l’homme, cela suggère un rôle pour ADAMTSL2 dans le développement des muscles squelettiques ou l’homéostasie6,7.
Le protocole que nous décrivons ici a été développé pour étudier le mécanisme par lequel ADAMTSL2 module le développement de muscle squelettique et/ou l’homéostasie dans un arrangement de culture cellulaire. Nous avons poignardé ADAMTSL2 dans la lignée de myoblastes murine C2C12. Les myoblastes C2C12 et leur différenciation en myotubes est un modèle de culture cellulaire bien décrit et largement utilisé pour la différenciation des muscles squelettiques et la bioingénierie des muscles squelettiques8,9. Les cellules C2C12 passent par des étapes distinctes de différenciation après le retrait de sérum, ayant pour résultat la formation des myotubes multinucleated après 3-10 jours dans la culture. Ces étapes de différenciation peuvent être surveillées de façon fiable en mesurant les niveaux d’ARNm de gènes marqueurs distincts, tels que la myod, la myogénine ou la chaîne lourde de myosine (MyHC). Un avantage de générer des renversements de gènes stables dans les cellules C2C12 est que les gènes qui sont exprimés à des stades ultérieurs de la différenciation C2C12 peuvent être ciblés plus efficacement, par rapport à l’élimination transitoire réalisée par l’ARN à petite interférence (si), qui dure généralement de 5 à 7 jours après la transfection, et est influencé par l’efficacité de la transfection. Un deuxième avantage du protocole tel que décrit ici est la génération relativement rapide de lots de cellules knockdown C2C12 en utilisant la sélection de puromycine. Les solutions de rechange, telles que l’élimination du gène CRISPR/Cas9 ou l’isolement des précurseurs des cellules musculaires squelettiques primaires provenant de souris humaines ou déficientes en gènes cibles, sont techniquement plus difficiles ou nécessitent la disponibilité de biopsies musculaires du patient ou de souris déficientes en gènes cibles, respectivement. Cependant, comme d’autres approches basées sur la culture cellulaire, il ya des limites dans l’utilisation des cellules C2C12 comme modèle pour la différenciation des cellules musculaires squelettiques, tels que la nature bidimensionnelle (2D) de la culture cellulaire mise en place et l’absence de microenvironnement in vivo qui est essentiel pour maintenir indifférenciées cellules précurseurs musculaires squelettiques10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour le knockdown stable des protéines d’ECM dans les myoblastes de C2C12 et pour l’analyse phénotypique de la différenciation des myoblastes de C2C12 dans les myotubes. Plusieurs facteurs déterminent l’issue de l’expérience et doivent être examinés attentivement. Le maintien des cellules C2C12 dans la phase proliférante est une étape critique pour maintenir les cellules C2C12 dans l’état précurseur du myoblaste. Le maintien de la capacité des cellules C2C12 à se di…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. est soutenu par les National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant number AR070748) et le fonds de démarrage du Département d’orthopédie Leni et Peter W. May, Icahn School of Medicine à Mont Sinaï.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
Referenzen
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