작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운
Summary
우리는 작은 머리핀 (sh) RNA를 사용하여 C2C12 근구 세포재이상체에서 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 코딩하는 유전자를 안정적으로 무너뜨리는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 C2C12 근강초 동안 mRNA, 단백질 및 세포 수준에서 의 녹다운 효율의 유효성을 검증하기 위한 방법을 myotube 분화로 표적화한다.
Abstract
세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 골격 근 발달과 항상성에 매우 중요합니다. C2C12 근구 세포체에서 ECM 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운은 골격 근력 발달에서 이러한 단백질의 역할을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 C2C12 세포에서 작은 헤어핀(sh) RNA를 사용하여 ECM 단백질 ADAMTSL2를 고갈시키기 위한 프로토콜을 예로 기술한다. shRNA 플라스미드의 형질감염 후, 안정한 세포는 푸로마이신을 사용하여 일괄 선택하였다. 우리는 또한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 C2C12 분화를 통해 이들 세포주의 유지 및 표현형 분석의 유지를 기술한다. 이 방법의 장점은 비교적 빠른 안정적인 C2C12 녹다운 세포의 생성과 세포 배양 배지에서 혈청의 고갈 시 다중 핵화 된 myotubes로 C2C12 세포의 신뢰할 수있는 분화이다. C2C12 세포의 분화는 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 및 MyoD, myogenin, 또는 myosin 중대체인 (MyHC)과 같은 정식 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 Myotube로 C2C12 근강변 분화의 진행을 나타내는 모니터링할 수 있습니다. 작은 간섭 (si) RNA를 가진 유전자의 과도 한 녹다운대조적으로, C2C12 분화 도중 또는 myotube 성숙 도중 나중에 표현되는 유전자는 shRNA를 안정적으로 발현하는 C2C12 세포를 생성해서 보다 효율적으로 표적으로 할 수 있습니다. 이 방법의 한계는 CRISPR/Cas9에 기초한 유전자 녹아웃 전략을 사용하여 극복될 수 있는 특정 shRNA에 따라 녹다운 효율의 가변성뿐만 아니라 고려해야 할 shRNA의 잠재적인 오프 타겟 효과이다.
Introduction
세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 모든 조직에 대한 구조적 지원을 제공하고 세포 세포 통신을 중재하며 세포 운명을 결정합니다. ECM의 형성 및 동적 리모델링은 따라서 조직 및 장기 항상성을 유지하는 데 중요합니다1,2. ECM 단백질을 위해 코딩하는 몇몇 유전자에 있는 병리학적인 이체는 근위축성에서 가성형성에구역 수색하는 표현형을 가진 근골격계 무질서를 초래합니다3,4. 예를 들어, ADAMTSL2의 병원성 변이체는 매우 드문 근골격계 질환인 겔레오피식 이형성증을 일으키며, 이는 가짜 근육, 즉 골격근 질량의 명백한증가5를제시한다. 마우스 및 인간에서유전자 발현 데이터와 함께, 이것은 골격 근 발달 또는 항상성6,7에서ADAMTSL2에 대한 역할을 시사한다.
우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 ADAMTSL2가 세포 배양 설정에서 골격 근육 발달 및 / 또는 항상성을 조절하는 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었습니다. 우리는 뮤린 C2C12 근강세포주에서 ADAMTSL2를 안정적으로 쓰러뜨렸습니다. C2C12 근세포 및 이들의 근체 내분체는 골격근 분화 및 골격근생물공학8,9에대해 잘 설명되고 널리 사용되는 세포 배양 모델이다. C2C12 세포는 혈청 철수 후 뚜렷한 분화 단계를 거치며, 배양 에서 3-10 일 후에 다중 핵화 된 myotubes의 형성을 초래합니다. 이러한 분화 단계는 MyoD, myogenin, 또는 myosin 중대체인(MyHC)과 같은 별개의 마커 유전자의 mRNA 수준을 측정함으로써 안정적으로 모니터링될 수 있다. C2C12 세포에서 안정적인 유전자 녹다운을 생성하는 한 가지 장점은 C2C12 분화의 후기 단계에서 발현되는 유전자가 형질감염 후 5-7일 동안 지속되고 형질전환 효율에 의해 전형적으로 지속되는 작은 간섭(si) RNA에 의해 달성된 과도적 녹다운에 비해 보다 효율적으로 표적화될 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 바와 같은 프로토콜의 제2 의제는 puromycin 선택을 사용하여 C2C12 녹다운 셀의 비교적 빠른 배치 생성이다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃 또는 인간 또는 표적 유전자 결핍 마우스로부터의 1차 골격 근 세포 전구체의 분리와 같은 대안은 기술적으로 더 도전적이거나 환자 근육 생검 또는 표적 유전자 결핍 마우스의 가용성을 각각 요구한다. 그러나, 다른 세포 배양 기반 접근법과 유사하게, C2C12 세포를 골격 근 세포 분화모델로 사용하는 데 한계가 있는데, 예를 들어 세포 배양체의 2차원(2D) 성질설정 및 미분화 골격근 전구체세포(10)를유지하는 데 중요한 생체내 미세환경의 부족.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에서 C2C12 근강초체에 있는 ECM 단백질의 안정한 녹다운을 위한 프로토콜및 myotubes로 C2C12 근세포의 분화의 표현형 분석을 위한 기술합니다. 여러 가지 요인이 실험 결과를 결정하며 신중하게 고려해야 합니다. 증식 상에서 C2C12 세포를 유지하는 것은 C2C12 세포를 근구 전구체 상태로 유지하는 중요한 단계이다. C2C12 세포의 능력을 유지하여 지속적으로 myotube로 분화하는 것은 i) 세포의 통…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H.는 국립 보건원 (국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소, NIAMS, 교부금 번호 AR070748)과 레니 & 피터 W. 월 정형 외과, 아이칸 의과 대학의 종자 기금에 의해 지원됩니다. 시나이 산.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
Referenzen
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