C2C12 Myoblast Hücre Hattında Ki Ekstrasellüler Matriks Proteinlerini Kodlayan Genlerin Kararlı Nakavtı Küçük Saç Tokası (sh)RNA
Summary
C2C12 miyoblastlarında küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak hücre dışı matriks (ECM) proteinlerini kodlayan genleri yere sermek için bir protokol sağlıyoruz. ADAMTSL2’yi örnek olarak hedefleyerek, C2C12 miyoblastı sırasında mRNA, protein ve hücresel düzeydeki nakavt etkinliğinin doğrulanması ve miyotube farklılaşması na yönelik yöntemleri tanımlıyoruz.
Abstract
Ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri iskelet kas gelişimi ve homeostaz için çok önemlidir. C2C12 miyoblastlarında ECM proteinleri için kodlayan genlerin kararlı nakavt iskelet kas gelişiminde bu proteinlerin rolünü incelemek için uygulanabilir. Burada, C2C12 hücrelerinde küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak ECM proteini ADAMTSL2’yi bir örnek olarak tüketen bir protokol uyguluyoruz. shRNA plazmidlerinin transfeksiyonundan sonra, kararlı hücreler puromisin kullanılarak toplu olarak seçilmiştir. Bu hücre hatlarının bakımını ve mRNA ekspresyonu, protein ekspresyonu ve C2C12 farklılaşması ile testotipik analizini de tanımlıyoruz. Yöntemin avantajları istikrarlı C2C12 knockdown hücrelerinin nispeten hızlı nesil ve hücre kültürü ortamda serum tükenmesi üzerine multinükleli miyotüpler içine C2C12 hücrelerinin güvenilir farklılaşması vardır. C2C12 hücrelerinin farklılaşması parlak alan mikroskobu ile ve MiyoD, miyojenin veya miyozin ağır zincir (MyHC) gibi kanonik marker genlerin ekspresyon düzeyleri ölçülerek, C2C12 miyoblastiasyonunun miyotüplere doğru ilerlemesini gösteren izlenebilir. Küçük interferans (si) RNA ile genlerin geçici nakavt aksine, daha sonra C2C12 farklılaşma sırasında veya myotube olgunlaşma sırasında ifade edilen genler daha verimli shRNA ifade C2C12 hücreleri üreterek hedeflenebilir. Yöntemin sınırlamaları, CRISPR/Cas9’a dayalı gen nakavt stratejileri kullanılarak aşılabilecek spesifik shRNA’ya bağlı olarak nakavt verimliliğindeki değişkenlik ve shRNA’nın göz önünde bulundurulması gereken potansiyel hedef dışı etkileridir.
Introduction
Hücre dışı matriks (ECM) proteinleri tüm dokular için yapısal destek sağlar, hücre-hücre iletişimine aracılık eder ve hücre kaderini belirler. Oluşumu ve ECM dinamik remodeling böylece doku ve organ homeostaz korumak için önemlidir1,2. ECM proteinleri için kodlayan çeşitli genlerdeki patolojik varyantlar kas distrofilerinden psödomousküler yapıya kadar çeşitli fenotiplerle kas-iskelet sistemi bozukluklarına yol açar3,4. Örneğin, ADAMTSL2 patojenik varyantları son derece nadir kas-iskelet bozukluğu geleofisik displazi neden, hangi psödomus yapı ile ortaya çıkar, yani, iskelet kas kütlesi belirgin bir artış5. Fare ve insanlarda gen ekspresyonu verileri ile birlikte, bu iskelet kas gelişimi veya homeostaz ADAMTSL2 için bir rol göstermektedir6,7.
Burada tanımladığımız protokol, ADAMTSL2’nin hücre kültürü ortamında iskelet kas gelişimini ve/veya homeostazını modüle etme mekanizmasını incelemek için geliştirilmiştir. Murine C2C12 miyoblast hücre hattında ADAMTSL2’yi yere serptik. C2C12 miyoblastlar ve miyotüpler içine farklılaşma iskelet kas farklılaşması ve iskelet kas biyomühendislik için iyi tanımlanmış ve yaygın olarak kullanılan hücre kültürümodeli8,9. C2C12 hücreleri serum çekilmesinden sonra farklı farklılaşma adımlarından geçerek kültürde 3−10 gün sonra çok çekirdekli miyotüplerin oluşmasına neden olur. Bu farklılaşma adımları, MyoD, miyojenin veya miyozin ağır zincir (MyHC) gibi farklı marker genlerinin mRNA düzeylerinin ölçülmesiyle güvenilir bir şekilde izlenebilir. C2C12 hücrelerinde kararlı gen knockdowns üreten bir avantajı C2C12 farklılaşma sonraki aşamalarında ifade edilen genler daha verimli hedeflenebilir, geçici knockdown ile karşılaştırıldığında (si) RNA, genellikle transfeksiyon sonra 5−7 gün sürer, ve transfeksiyon verimliliği etkilenir. Burada açıklandığı gibi protokolün ikinci bir avantajı puromisin seçimi kullanarak C2C12 knockdown hücrelerinin toplu nispeten hızlı nesil. CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtı veya birincil iskelet kas hücresi öncüllerinin insan veya hedef-gen eksikliği olan farelerden izolasyonu gibi alternatifler teknik olarak daha zorludur veya hasta kas biyopsilerinin veya hedef geni eksik farelerin bulunmasını gerektirir. Ancak, diğer hücre kültürü tabanlı yaklaşımlara benzer şekilde, c2C12 hücrelerinin iskelet kas hücresi farklılaşması için model olarak kullanımında sınırlamalar vardır, hücre kültürü kurulumu nun iki boyutlu (2D) doğası ve farklılaşmamış iskelet kas öncül hücrelerinin korunması için kritik olan in vivo mikroortamın eksikliği10gibi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada C2C12 miyoblastlarında ECM proteinlerinin kararlı bir şekilde yıkılması ve C2C12 miyoblastlarının miyotüplere farklılaşmasının henotik analizi için bir protokol uyguluyoruz. Deney sonucunu çeşitli faktörler belirler ve dikkatle düşünülmeli. C2C12 hücrelerinin çoğalma aşamasında tutulması, C2C12 hücrelerini miyoblast öncül durumunda tutmak için kritik bir adımdır. C2C12 hücrelerinin sürekli miyotüpler içine ayırt etmek için yeteneğini istinat i) hücrelerin geçiş sayısı, …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. Ulusal Sağlık Enstitüleri (Ulusal Artrit ve Kas İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü, NIAMS, hibe numarası AR070748) ve Leni & Peter W. Mayıs Ortopedi Bölümü, Icahn Tıp Fakültesi tohum finansmanı tarafından desteklenir Sina Dağı.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
Referenzen
- Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
- Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
- Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
- Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
- Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
- Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
- Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
- Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
- Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
- Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
- Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
- Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
- Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
- Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
- Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
- Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
- Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
- Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
- Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
- Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
- Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
- Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
- Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science’s STKE. 2003 (192), 11 (2003).
- Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
