Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria
Summary
Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.
Abstract
È stato riferito che le dimensioni e la forma delle spine dendritiche sono legate alla loro plasticità strutturale. Per identificare la struttura morfologica dei neuroni piramidali e delle spine dendritiche, può essere utilizzata una tecnica di etichettatura balistica. Nel protocollo attuale, i neuroni piramidali sono etichettati con dilC18(3) tintura e analizzati utilizzando un software di ricostruzione neuronale per valutare la morfologia neuronale e le spine dendritiche. Per studiare la struttura neuronale, vengono eseguite analisi di ramificamento dendritiche e analisi Sholl, consentendo ai ricercatori di trarre deduzioni rispettivamente sulla complessità della ramificazione dendritica e sulla complessità neuronale del rogo. La valutazione delle spine dendritiche viene condotta utilizzando un algoritmo di classificazione automatica assistita integrale del software di ricostruzione, che classifica le spine in quattro categorie (ad esempio, sottile, fungo, tozzo, filopodia). Inoltre, vengono scelti altri tre parametri (ad esempio, lunghezza, diametro della testa e volume) per valutare le alterazioni nella morfologia della colonna vertebrale dendritica. Per convalidare il potenziale di ampia applicazione della tecnica di etichettatura balistica, i neuroni piramidali della coltura cellulare in vitro sono stati etichettati con successo. Nel complesso, il metodo di etichettatura balistica è unico e utile per visualizzare i neuroni in diverse regioni del cervello nei ratti, che in combinazione con un sofisticato software di ricostruzione, consente ai ricercatori di chiarire i possibili meccanismi alla base disfunzione neurocognitiva.
Introduction
Nel 2000, Gan et al. ha descritto una tecnica di etichettatura rapida per singoli neuroni e glia nel sistema nervoso che combinava vari coloranti lipofilici, consentendo l’etichettatura simultanea di molte cellule cerebrali con colori diversi1,2. Più recentemente, una tecnica di etichettatura balistica è stata descritta da Seabold et al.3 che ha introdotto coloranti fluorescenti (Dil) nei neuroni delle fette cerebrali. Una tecnica di colorazione versatile, l’etichettatura balistica è apprezzata per la sua capacità di essere utilizzata in più specie animali e in un’ampia gamma di età. Inoltre, può essere combinato con l’immunostaining per identificare le sottopopolazioni di cellule cerebrali3. Rispetto alle tecniche tradizionali (ad esempio, impregnazione dell’argento Golgi-Cox, microiniezione)4, l’etichettatura balistica offre l’opportunità di distinguere più chiaramente le caratteristiche morfologiche, tra cui le spine dendritiche, una caratteristica che è fondamentale per trarre deduzioni sulla complessità neuronale e la connettività sinaptica5 .
I neuroni piramidali eccitatori sono caratterizzati da un singolo, grande dendrite apicale, più dendriti basali più brevi e migliaia di spine dendritiche6. I neuroni piramidali si trovano in più regioni del cervello legate all’elaborazione cognitiva di ordine superiore, tra cui la corteccia prefrontale (PFC) e l’ippocampo. Nel PFC, i neuroni piramidali sono osservati negli strati II/III e nello strato V, con ciascuno che mostra una morfologia unica. In particolare, i neuroni piramidali nello strato II/III del PFC hanno un dendrite apicale più breve e meno ramificati rispetto ai neuroni piramidali nello strato V6. All’interno dell’ippocampo, i neuroni piramidali si trovano sia nelle regioni CA1 che IN CA3, ognuna delle quali mostra morfologie distinte. In particolare, i neuroni piramidali nella regione CA1 presentano una dendrite apicale più distintiva, con ramificature più lontane dal soma, rispetto alla regione CA36.
Spine dendritiche sui neuroni piramidali sia nel PFC che nell’ippocampo sono il sito primario di sinapsi eccitatorie7. Le caratteristiche morfologiche delle spine dendritiche, che sono classicamente caratterizzate in tre categorie primarie (cioè sottili, tozze o funghi8), sono state correlate alla dimensione della sinapsi eccitatoria9. Le spine sottili, caratterizzate da un collo lungo e sottile, una piccola testa bulbosa e densità post-sinaptiche più piccole, sono più instabili e sviluppano connessioni più deboli. Tuttavia, le spine di funghi, che hanno una testa dendritica più grande della colonna vertebrale, sono riconosciute per la formazione di connessioni sinaptiche più forti, un effetto derivante dalle loro dimensioni più grandi. In netto contrasto, le spine tozze sono prive di un collo della colonna vertebrale, mostrando un rapporto di volume testa e collo approssimativamente uguale8. All’interno dell’ippocampo, possono anche essere osservate spine ramificate, per cui la colonna vertebrale ha più teste che emergono dallo stesso collo dendritico della colonna vertebrale10. Pertanto, i cambiamenti morfologici delle spine dendritiche potrebbero riflettere la funzionalità e la capacità strutturale. Inoltre, studi hanno dimostrato che le dimensioni e la forma delle spine dendritiche si riferiscono alla loro plasticità strutturale, portando all’idea che piccole spine sono coinvolte nell’apprendimento e nell’attenzione, mentre le spine più grandi e più stabili, sono coinvolte in processi a lungo termine, compresa la memoria11. Inoltre, la distribuzione delle spine dendritiche lungo la dendrite può essere associata alla connettività sinaptica5,12.
Così, l’attuale carta metodologica ha tre obiettivi: 1) Presentare il nostro protocollo per l’etichettatura balistica, che è stato utilizzato con un tasso di successo (cioè neuroni che soddisfano i criteri di selezione e appropriato per l’analisi) di 83.3%5,12,13 e attraverso più regioni del cervello (cioè, PFC, nucleo accumbens, ippocampo); 2) dimostrare la generalizzabilità della tecnica e la sua applicazione ai neuroni cresciuti in vitro; 3) Dettaglio la metodologia utilizzata nel software di ricostruzione neuronale e le deduzioni che possono essere tratte da tali dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo una tecnica di etichettatura versatile per i neuroni sia dal cervello del ratto che da quelli cresciuti in vitro. Inoltre, riportiamo la metodologia per l’utilizzo di software di ricostruzione neuronale e software di analisi quantitativa di ricostruzione neuronale per valutare la morfologia neuronale e le spine dendritiche. La valutazione della morfologia neuronale e delle spine dendritiche offre l’opportunità di determinare le alterazioni della complessità della ramificazione dendriti…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da NIH sovvenzioni HD043680, MH106392, DA013137, e NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
Referenzen
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- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
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