뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링
Summary
우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 피라미드 형 뉴런과 수지상 척추의 형태 학적 구조를 식별하기 위해 탄도 라벨링 기술을 활용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 피라미드 형 뉴런은 DilC18 (3) 염료로 표지되고 신경 형태 및 수지상 척추를 평가하기 위해 뉴런 재건 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 신경 구조를 조사하기 위해 수지상 분기 분석과 Sholl 분석을 수행하여 연구원들이 수지상 분기 복잡성과 뉴런 아버 복잡성에 대한 추론을 각각 그릴 수 있습니다. 수지상 척추의 평가는 재건 소프트웨어에 필수적인 자동 보조 분류 알고리즘을 사용하여 수행되며, 척추를 네 가지 범주 (즉, 얇은, 버섯, 스터비, 필로포디아)로 분류합니다. 또한 수지상 척추 형태학의 변경을 평가하기 위해 추가적인 세 가지 매개변수(예: 길이, 머리 직경 및 부피)도 선택됩니다. 탄도 라벨링 기술의 광범위한 적용 가능성을 검증하기 위해 시험관 내 세포 배양으로부터의 피라미드 뉴런이 성공적으로 표지되었습니다. 전반적으로, 탄도 라벨링 방법은 쥐의 다른 뇌 영역에서 뉴런을 시각화하는 데 독특하고 유용하며, 정교한 재건 소프트웨어와 함께 연구자들은 근본적인 가능한 메커니즘을 해명 할 수 있습니다. 신경 인지 기능 장애.
Introduction
2000년, Gan et al.은 다양한 친유성 염료를 결합한 신경계에서 개별 뉴런및 글리아에 대한 신속한 라벨링 기술을 설명하여, 다른 색을 가진 많은 뇌 세포의 동시 라벨링을허용1,,2. 더 최근에, 탄도 표지 기술은 Seabold 등.3 뇌 조각의 뉴런으로 형광 염료 (Dil)를 도입했다고 기술되었습니다. 다재다능한 염색 기술인 탄도 라벨링은 여러 동물 종과 다양한 연령대에서 활용될 수 있는 능력으로 평가받고 있습니다. 또한, 뇌 세포의 하위 집단을 식별하기 위해 면역 염색과 결합 될 수있다3. 기존의 기법(예를 들어, 골지콕스 은침, 미세주입)과 비교하여4,탄도 라벨링은 수지상 척추를 포함한 형태학적 특성을 보다 명확하게 구별할 수 있는 기회를 제공하며, 이는 뉴런복잡성 및 시냅스 연결성에 대한 추론을 그리는 데 중요한특징이다5.
흥분성 피라미드 뉴런은 단일, 큰 상피 덴드라이트, 다중 짧은 기저 모수석, 및 수지상 척추의 수천을 특징으로한다6. 피라미드 뉴런은 전두엽 피질 (PFC) 및 해마를 포함하여 더 높은 차수인지 처리와 관련된 여러 뇌 영역에서 발견됩니다. PFC에서, 피라미드 뉴런은 층 II/III 및 층 V에서 관찰되며, 각각고유한 형태를 나타낸다. 구체적으로, PFC의 층 II/III에 있는 피라미드형 뉴런은 층V6에있는 피라미드 형 뉴런 보다는 더 짧은 정점 수상돌기 및 더 적은 분기가 있습니다. 해마 내에서 피라미드 형 뉴런은 CA1 및 CA3 영역 모두에 위치하며 각 신경 세포는 뚜렷한 형태를 표시합니다. 구체적으로, CA1 영역의 피라미드 형 뉴런은 CA3 영역6에비해 소마로부터 더 멀리 발생하는 분기와 함께 보다 독특한 정점 수상돌기를 나타낸다.
PFC와 해마 둘 다에 있는 피라미드 형 뉴런에 수지상 척추는 흥분성의 시냅스의 1 차적인 사이트입니다7. 수지상 척추의 형태학적 특성은 고전적으로 3가지 1차 범주(즉, 얇고, 스터비, 또는 버섯8)로특징지어지며, 흥분성 시냅스9의크기와 관련이 있다. 길고 얇은 목, 작은 구근 머리 및 작은 후두 밀도를 특징으로하는 얇은 척추는 더 불안정하고 약한 연결을 개발합니다. 그러나, 버섯 척추, 더 큰 수지상 척추 머리, 강한 시 냅 스 연결을 형성에 대 한 인식, 그들의 더 큰 크기에서 발생 하는 효과. 선명한 대조적으로, 스터비 척추는 척추 목이없는, 거의 동등한 머리와 목 볼륨 비율을 나타내는8. 해마 내에서, 분지 된 척추는 또한 관찰 될 수 있으며, 척추는 동일한 수지상 척추 목(10)에서나타나는 여러 개의 머리를 가지고 있다. 따라서 수지상 척추의 형태학적 변화는 기능과 구조적 능력을 반영할 수 있습니다. 또한 수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있으며, 작은 척추가 학습과 관심에 관여하는 반면, 더 크고 안정적인 척추는 기억11을포함한 장기 프로세스에 관여한다는 것을 입증했습니다. 부가적으로, 수상돌기를 따라 수지상 척추의 분포는 시냅스 연결과 연관될 수 있다5,,12.
따라서, 본 방법론 논문은 세 가지 목표를 갖는다: 1) 탄도 라벨링에 대한 우리의 프로토콜을 제시, 이는 성공률로 활용되고있다 (즉, 뉴런은 선택 기준을 충족하고 분석에 적합한) 의 83.3%55,12,,13 및 여러 뇌 영역 (즉, PFC, 핵 accumbens, 해마); 2) 시험관내에서 성장한 뉴런에 대한 기술의 일반화 및 그 적용성을 입증한다; 3) 신경 재건 소프트웨어에 활용된 방법론과 그러한 데이터로부터 도출될 수 있는 추론을 상세히 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 쥐 뇌와 시험관 내에서 자란 뉴런에 대한 다목적 라벨링 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 신경 형태와 수지상 척추를 평가하기 위해 신경 재건 소프트웨어 및 신경 재건 정량 분석 소프트웨어를 활용하는 방법론을보고합니다. 신경 형태와 수지상 척추의 평가는 수지상 분기 복잡성, 신경 아버 복잡성, 수지상 척추 형태 및 시냅스 연결의 변화를 결정할 수있는 기회를 제공합니…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 HD043680, MH106392, DA013137 및 NS100624에 의해 지원되었다.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
Referenzen
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- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
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